本发明涉及一种从天然中药中获得的环维黄杨星D衍生物的制备方法，确切的说是一种以中药提取的化学成分为先导化合物，制备一系列衍生物，以抗阿尔茨海默病活性为目的进行结构修饰，属于医药领域。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是一种中老年常见的以渐行性记忆力减退、认知功能障碍、人格改变为特征的中枢神经系统退行性疾病，且随着世界人口老龄化的加剧，全球阿尔茨海默病病人已经超过3500万，将带来诸多的社会和经济问题。因此对AD的防治已成为十分迫切的社会与医学问题。目前AD治疗药物种类繁多，已上市或正在进入临床研究的药物有乙酰卡尼汀、他可林、维那克林、水飞蓟素、毒扁豆碱等，其药品毒副作用都较大，且多为对症治疗，疗效不确切、特异性不强、毒副作用大、不易透过血脑屏障等，限制了其临床应用，因此开发高效低毒阿尔茨海默病防治药物一直是国内外医药界的研究热点。环维黄杨星D是从小叶黄杨BuxusmicrophyllaSieb.etZucc.var.sinicaRehd.etWils.及同属植物中经提取、D101、ODS柱分离得到的一种孕甾烷类生物碱化合物。我们的研究已经证明了环维黄杨星D具有抗阿尔茨海默病的药理活性(专利公开号：CN104693265A)。因此，本发明的目的在于对环维黄杨星D进行结构改造，制备一系列衍生物，以期寻找对阿尔茨海默病有更强的治疗作用的新的生物碱类化合物。在本发明完成之前，还没有文献报道环维黄杨星D衍生物具有抗阿尔茨海默病的作用，也未发现环维黄杨星D衍生物在制备抗阿尔茨海默病药物中应用的报道。
技术实现要素：
本发明在于提供一种以环维黄杨星D为先导化合物合成一系列具有抗阿尔茨海默病作用的环维黄杨星D衍生物。本发明的目的是通过以下技术方案得以实现：1、乙醇提取中药小叶黄杨(BuxusmicrophyllaSieb.etZucc.var.sinicaRehd.etWils.)，经纯化、ODS柱分离而获得的化合物环维黄杨星D(CyclovirobuxinD)。2、环维黄杨星D溶于CH2Cl2中，缓慢滴加各种酰氯，再加入三乙胺，常温条件下搅拌，待反应完全，减压回收溶剂，干燥，得粗产物。粗产物用硅胶柱分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5：2)，得白色粉末状的化合物1-12。表1各衍生物的化学结构以上所述的各种具有抗阿尔茨海默病的环维黄杨星D衍生物，可用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。本发明的特点为：对天然产物环维黄杨星D进行化学修饰，得到一系列与环维黄杨星D结构相似的衍生物，首次经酶学及细胞实验证明，具有较好的治疗阿尔茨海默病作用，且一些衍生物的活性优于母体化合物环维黄杨星D及阳性药盐酸多奈哌齐，体现了本发明的先进性及创新性，具有明显的技术进步。环维黄杨星D及衍生物的药理作用，通过以下药效学实验得到证实的。细胞人神经母细胞瘤细胞购自上海中科院细胞所。药品及试剂环维黄杨星D及其衍生物为实验室自制；阳性对照药盐酸多奈哌齐由卫材药业有限公司制造(批号：130311A)。乙酰胆碱酯酶由上海源叶生物科技有限公司生产(≥200U/g)。1.环维黄杨星D及衍生物体外抑制乙酰胆碱酯酶活性试验乙酰胆碱酯酶(AChE)溶液的配制：100U的乙酰胆碱酯酶被溶解于50mL的Tris-HCl(0.05M，pH＝7.8)缓冲液中，再加入50mg的小牛血清蛋白稳定酶液，即得2U/mL的酶溶液。2U/mL的酶液用pH＝8.0的PBS稀释成0.5U/mL的酶液供Ellman法使用。2mM5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的配制：3.96mgDTNB先用500μL的无水乙醇溶解，再加1.5mgNaHCO3，然后用pH＝7.0的PBS定容到5mL。15mM碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)的配制：21.67mgATCI加蒸馏水溶解并定容至5mL。4℃冰箱保存。样品孔：在酶标板小孔中加入140μLPBS缓冲液(0.1M，pH＝8.0)，20μL待测样品溶液和15μL酶溶液，混合均匀后在4℃保存20min。取出加入10μLDTNB(2mM)和10μLATChI(15mM)，在37℃反应20min后即可在405nm读取吸光度值。样品本底对照孔：用15μLPBS缓冲液代替15μL酶溶液，其它条件不变。空白对照孔：用20μLPBS缓冲液代替20μL待测样品溶液，其它条件不变。实验结果见表2。衍生物7、10、11、12的抑制活性最好，较阳性对照药盐酸多奈哌齐及先导化合物具有更强的抑制活性。表2环维黄杨星D及衍生物的IC50值2.环维黄杨星D及衍生物对Aβ25-35诱导人神经母细胞瘤细胞株细胞(SH-SY5Y)损伤的神经保护作用SH-SY5Y细胞株按常规方法传代培养，取对数期生长的细胞，按1.5×105个/孔接种于96孔板，放入37℃CO2培养箱中，使之完全贴壁。弃去旧培养液，在各孔中加入各样品溶液，浓度梯度分别设置为5、10、25、50、100μg/mL，每种浓度均为三个复孔，孵育12h。吸去旧培养液，将20μmol/mLAβ25-35加入各浓度梯度样品溶液的细胞孔中，并共同孵育24h；再次吸去旧培养液，每孔20μL5mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4h，弃去液体，每孔加入200μLDMSO，震荡15min。用酶标仪在570nm下测定吸收值。本实验同时将细胞分为正常细胞组(只加培养液)、Aβ25-35诱导细胞分化组(加Aβ25-35、培养液代替样品溶液)、阳性药盐酸多奈哌齐对照组(盐酸多奈哌齐溶液代替样品溶液)、空白孔(只加入药液和培养液，不加细胞)；并且设置相应的浓度梯度，各组细胞的培养情况同样品组，每种浓度均为三个复孔。采用EXCEL软件建立数据库并用SPSS13.0软件包进行分析，用定量指标进行统计学描述。结果表明，环维黄杨星D及衍生物对SH-SY5Y细胞均有不同程度的保护作用，从表3中可以看出，化合物1、7、11、12对SH-SY5Y细胞保护作用最强，细胞的存活率较高，而其他化合物对SH-SY5Y细胞的保护性相对较差，但与阳性药盐酸多奈哌齐细胞存活率相差不大，说明各衍生物均具有很强的抗阿尔茨海默病的作用。表3各衍生物对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞的存活率的影响表4各衍生物对SH-SY5Y细胞的半数有效量情况利用MTT法评价衍生物1-12对Aβ25-35诱导的人神经母细胞瘤细胞株细胞(SH-SY5Y)损伤的神经保护作用，这些化合物对Aβ25-35诱导的人神经母细胞瘤细胞株细胞(SH-SY5Y)损伤的神经保护作用与体外酶学实验结果一致，从而也揭示了环维黄杨星D衍生物通过改善胆碱能系统损伤以达到防治阿尔茨海默病的作用。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。但下述的实施例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。实施例1环维黄杨星D制备方法小叶黄杨药材5kg粉碎成粗粉，用含1％冰乙酸的70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，加入药液体积0.2％活性炭，搅拌，过滤，滤液减压回收乙醇得浸膏，加水溶解，使每1ml含1g药材，用氢氧化钠调PH为10，用三氯甲烷萃取，得总生物碱；生物碱先用硅胶柱分离(三氯甲烷-甲醇＝5：1)，得到环维黄杨星D粗品。取环维黄杨星D粗品用甲醇溶解，通过ODS常压色谱柱，以乙腈-水(25：75)为流动相洗脱，合并环维黄杨星D组分，重结晶得到环维黄杨星D。白色结晶，分子式C26H46N2O，分子量402.7。实施例2化合物1制备方法环维黄杨星D0.42g溶于25mL的CH2Cl2中，缓慢滴加0.5mL的苯甲酰氯，再加入0.5mL的三乙胺，常温条件下搅拌，待反应完全，减压回收溶剂，干燥，得粗产物。粗产物先用硅胶柱分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5：2)，得化合物1，产率为75.32％，白色粉末。实施例3化合物2-12的制备方法制法同实施例2，产率均大于60％，白色粉末。