技术领域本发明涉及一种压电适体传感器的制备方法，尤其涉及基于智能水凝胶的压电适体传感器及其制备方法和其在人凝血酶的检测方面的应用。
背景技术：
凝血酶是一种由凝血酶前体形成的丝氨酸蛋白质水解酶，能将纤维蛋白元催化成纤维蛋白，具有促进血液凝固、控制凝血等作用。机体内的凝血酶必须保持在一定的范围内，因为过度的凝血将会引起血栓等疾病，甚至导致机体死亡。凝血酶对于揭示肿瘤的发生机制及作为早期诊断以及愈后的依据，在医学检测方面有重大的意义。由于血液中凝血酶的浓度达到nM/L级别，建立简单、快速、高灵敏度检测凝血酶的方法具有非常重要的意义。现有的电化学传感器制作过程繁琐、需结合信号放大技术，导致检测过程复杂，精度不足。而将适体作为识别元件与电化学生物传感器结合在一起所构建的电化学适体传感器，集成了适体和电化学传感器两方面的优势，既具有电化学传感器的高灵敏度、快响应、简单操作、低成本，又具有适体的高选择性和特异性基于智能水凝胶的压电适体传感器，无需经典的免疫分析方法如放射性同位素标记法及酶联耦合方法中的标记和分离步骤，可以简化分析操作程序，提高分析速度，因此具有响应快、特异性好、小型简便等特点，在凝血酶检测的实际应用中潜力巨大。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是在于现有技术的不足，提供一种基于智能水凝胶的压电适体传感器，该压电适体传感器能够用于人凝血酶的快速检测。项目研究表明：丙烯酰胺、TBA29、ssDNA三种单体以10:1:1的比例合成水凝胶，在30分钟内能够直接检测到1nM凝血酶。与未采用该水凝胶构建的压电适体传感器相比，其灵敏度提高了一个数量级。本发明基于智能水凝胶的压电适体传感器是采用分子自主装技术将由丙烯酰胺、TBA29、ssDNA三种单体通过共聚反应合成的水凝胶修饰于金表面；其中丙烯酰胺、TBA29与ssDNA的体积比为10～1000:1:1，优选比例为10:1:1；所述的TBA29为5′-Acrydite-TBA29，其碱基序列为：5′-Acrydite-TCCTAATACGACTCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTTATTGAAAACGCG-3′，如SEQIDNO.1所示。所述的ssDNA为5′-Acrydite-ssDNA，其碱基序列：5′-Acrydite-CGCGTTTTCAATAGAGTCGTATTAGGA-3′，如SEQIDNO.1所示。本发明的第二个目的是提供上述基于智能水凝胶的压电适体传感器的制备方法，该方法包括以下步骤：步骤(1)：将传感器的金表面依次经1MNaOH、1MHCl分别处理5分钟、2分钟，每次处理后都用去离子水冲洗，最后进行氮气干燥。步骤(2)：步骤(1)清洗后的传感器在10mM的MHDA酒精溶液中过夜。所述的MHDA酒精是指将酒精作为溶液溶解MHDA(二乙酰己二胺)。步骤(3)：注射EDC/NHS混合液，反应10分钟；其中EDC/NHS混合液中EDC的浓度为75mM，NHS的浓度为30mM；步骤(4)：水洗后注射水凝胶，反应30分钟；步骤(5)：水洗后注射Tris-HCl，待平衡；步骤(6)：注射人凝血酶，反应30分钟；步骤(7)：Tris-HCl清洗，待平衡后即得到所需的基于水凝胶的压电适体传感器。所述的EDC/NHS(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺)混合液、水凝胶、人凝血酶的体积比为1:1:1。所述的水凝胶的制备方法如下：1)将体积份数为8.8×10-3～0.88份的丙烯酰胺(质量体积含量为2％，单位为g/mL)与体积份数为2份的TBA-TBE(浓度为0.5μM，TBE为Tris硼酸)混合，得到溶液A；TBA-TBE是指以TBE为溶剂，TBA为溶质配成的溶液；2)将体积份数为8.8×10-3～0.88份的丙烯酰胺(质量体积含量为2％，单位为g/mL)与体积份数为2份的ssDNA-TBE(浓度为0.5μM)混合，得到溶液B；所述的ssDNA-TBE是指以TBE为溶剂，ssDNA为溶质配成的溶液；3)将体积份数为5份超纯水与过硫酸铵、0.25份TEMED(四甲基乙二胺)混合得到催化剂C；其中每500μL超纯水加入0.05g过硫酸铵；4)首先将溶液A通氮除氧10分钟，然后加入催化剂C后，继续通氮除氧十分钟；其中溶液A中质量体积含量为2％的丙烯酰胺与催化剂C的体积比为0.88:1；5)首先将溶液B通氮除氧10分钟，然后加入催化剂C后，继续通氮除氧十分钟；其中溶液B中质量体积含量为2％的丙烯酰胺与催化剂C的体积比为0.88:1；6)将步骤4)处理后的溶液A与步骤5)处理后的溶液B等体积混合，合成水凝胶。本发明的第三个目的是提供上述基于智能水凝胶的压电适体传感器应用于人凝血酶的检测，采用AFM对传感器的制作和检测过程进行表征。AFM图像证明了水凝胶在传感器表面修饰成功，并能够捕获目标。凝血酶浓度为0.1-10Units/mL范围时，传感器的频率响应随着凝血酶浓度的增加而增加；但是，二者之间并不是线性关系。研究结果表明：基于水凝胶(丙烯酰胺:TBA29:ssDNA＝10:1:1)构建的适体传感器灵敏度最高，能够检测到0.1个UN单位。根据Sigma提供的说明书进行单位换算，0.1个UN单位相当于0.866nM的凝血酶，因此，该适体传感器可以直接检测到1nM级的凝血酶，表现出一定的优越性。本发明的有益效果是：本发明制备的基于智能水凝胶的压电适体传感器的自组装技术，方法简单、操作简便。本发明制备的基于智能水凝胶的压电适体传感器用于人凝血酶的检测方法简便易行、响应时间短且检测成本低，实现了对人凝血酶的快速检测。该适体传感器可以直接检测到1nM级的凝血酶，表现出一定的优越性。本发明加快了该压电适体传感器商业化的步伐；在未来应用中，用于凝血酶的快速检测技术对于及早发现和干预恶性肿瘤的暴发，避免给个人、家庭、以及社会造成严重的经济损失等具有重大意义！附图说明图1是本发明合成水凝胶结构示意图；图2是本发明水凝胶合成过程示意图；图3是本发明ssDNA/适体水凝胶响应目标分析物的原理示意图；图4是本发明适体传感器制作过程示意图；图5是本发明AFM表征；图6是本发明基于hydrogelII制作的QCM适体传感器检测不同浓度人凝血酶的曲线图；图7是本发明采用不同水凝胶制作的QCM适体传感器检测人凝血酶对比图；图8是本发明传感器的性能及表征。本发明基于智能水凝胶的压电适体传感器的制备及用于人凝血酶的检测方法过程如图6所示，具体操作过程如下：下面实施例方法的原理流程图如图4所示。实施例1：1、QCM金电极的清洗1MNaOH浸泡5分钟；去离子水冲洗、氮气干燥；1MHCl浸泡2分钟；去离子水冲洗、氮气干燥；2、水凝胶为丙烯酰胺:TBA29:ssDNA＝1000:1:1，如图1、2所示：溶液A：88μL丙烯酰胺(2％)+200μLTBA-TBE(0.5μM)溶液B：88μL丙烯酰胺(2％)+200μLssDNA-TBE(0.5μM)催化剂C：0.5mL超纯水+0.05g过硫酸铵+25μLTEMED溶液A通氮除氧10分钟，加入100μL现配的催化剂C，继续通氮除氧十分钟。溶液B通氮除氧10分钟，加入100μL现配的催化剂C，继续通氮除氧十分钟。等体积溶液A与溶液B混合，合成水凝胶。3、上述基于智能水凝胶的压电适体传感器制备方法包括以下六步：1)清洗后的晶体在10mM的MHDA酒精溶液中过夜2)注射200μLEDC/NHS(75mM/30mM)，反应10分钟3)水洗后注射200μL水凝胶，反应30分钟4)水洗后注射Tris-HCl，待平衡5)注射200μL人凝血酶，反应30分钟6)Tris-HCl清洗，待平衡实施例2：1、QCM金电极的清洗1MNaOH浸泡5分钟；去离子水冲洗、氮气干燥；1MHCl浸泡2分钟；去离子水冲洗、氮气干燥；2、水凝胶为丙烯酰胺:TBA29:ssDNA＝100:1:1，如图1、2所示：溶液A：8.8μL丙烯酰胺(2％)+200μLTBA-TBE(0.5μM)溶液B：8.8μL丙烯酰胺(2％)+200μLssDNA-TBE(0.5μM)催化剂C：0.5mL超纯水+0.05g过硫酸铵+25μLTEMED溶液A通氮除氧10分钟，加入100μL现配的催化剂C，继续通氮除氧十分钟。溶液B通氮除氧10分钟，加入100μL现配的催化剂C，继续通氮除氧十分钟。等体积溶液A与溶液B混合，合成水凝胶。3、上述基于智能水凝胶的压电适体传感器制备方法包括以下六步：1)清洗后的晶体在10mM的MHDA酒精溶液中过夜2)注射200μLEDC/NHS(75mM/30mM)，反应10分钟3)水洗后注射200μL水凝胶，反应30分钟4)水洗后注射Tris-HCl，待平衡5)注射200μL人凝血酶，反应30分钟6)Tris-HCl清洗，待平衡实施例3：1、QCM金电极的清洗1MNaOH浸泡5分钟；去离子水冲洗、氮气干燥；1MHCl浸泡2分钟；去离子水冲洗、氮气干燥；2、水凝胶为丙烯酰胺:TBA29:ssDNA＝1000:1:1，如图1、2所示：溶液A：0.88μL丙烯酰胺(2％)+200μLTBA-TBE(0.5μM)溶液B：0.88μL丙烯酰胺(2％)+200μLssDNA-TBE(0.5μM)催化剂C：0.5mL超纯水+0.05g过硫酸铵+25μLTEMED溶液A通氮除氧10分钟，加入100μL现配的催化剂C，继续通氮除氧十分钟。溶液B通氮除氧10分钟，加入100μL现配的催化剂C，继续通氮除氧十分钟。等体积溶液A与溶液B混合，合成水凝胶。3、上述基于智能水凝胶的压电适体传感器制备方法包括以下六步：1)清洗后的晶体在10mM的MHDA酒精溶液中过夜2)注射200μLEDC/NHS(75mM/30mM)，反应10分钟3)水洗后注射200μL水凝胶，反应30分钟4)水洗后注射Tris-HCl，待平衡5)注射200μL人凝血酶，反应30分钟6)Tris-HCl清洗，待平衡传感器性能及表征：如图5所示，AFM图像证明了水凝胶在传感器表面修饰成功，并能够捕获目标。以TBA29直接修饰晶体、构建的适体传感器作为本项目构建的水凝胶适体传感器的对照，研究基于水凝胶构建的适体传感器性能。基于智能水凝胶的压电适体传感器原理如图3所示。检测结果如图6、7所示。研究结果表明：基于水凝胶(丙烯酰胺:TBA29:ssDNA＝10:1:1)构建的适体传感器灵敏度最高，能够检测到0.1个UN单位。根据Sigma提供的说明书进行单位换算，0.1个UN单位相当于0.866nM的凝血酶。以TBA29直接修饰晶体、构建的适体传感器作为本项目构建的水凝胶适体传感器的对照，研究基于水凝胶构建的适体传感器性能。如图8所示，不采用水凝胶的适体传感器在凝血酶为1个UN单位时，检测不到可识别的信号；在凝血酶为5个UN单位时能够明显的检出信号。而基于水凝胶构建的适体传感器，在凝血酶为1个UN单位时均能检出明显信号；其中基于水凝胶(丙烯酰胺:TBA29:ssDNA＝10:1:1)构建的适体传感器，能够检测到0.1个UN单位的凝血酶。研究结果表明：采用智能水凝胶构建的适体传感器将灵敏度提高了一个数量级。同时也说明未修饰水凝胶的传感器不能够检测该数量级的人凝血酶。该试验说明本发明所制备的基于智能水凝胶的压电适体传感器在人凝血酶的检测上更具有优势。SEQUENCELISTING<110>杭州电子科技大学<120>基于智能水凝胶的压电适体传感器及其制备方法和应用<130>1<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>56<212>DNA<213>人工合成<400>1tcctaatacgactcagtccgtggtagggcaggttggggtgacttattgaaaacgcg56<210>2<211>27<212>DNA<213>人工合成<400>2cgcgttttcaatagagtcgtattagga27