技术领域本发明属于生物技术领域，特别涉及一种小体鲟实时荧光PCR特异性检测体系及应用。
背景技术：
小体鲟(学名：Acipenserruthenus)，为鲟形目鲟科鲟属的鱼类，主要分布于欧洲俄罗斯地区，在我国主要分布于额尔齐斯河流域，并已经在成都、山东和北京等地区试养，适宜在我国东北、西北、西南地区偏冷水水库和湖泊增养殖。小体鲟身体呈长锥形，体色变化较大，背部常呈深灰褐色，腹部黄白色；体被5行骨板，骨板行间散布着小梳状颗粒；吻突有稍钝或尖状两种类型，口小、横裂，下唇中部断开(相对于裸腹鲟而言)；与其他鲟鱼的区别特征是：下领的中间部位有小口，侧骨板数超过50枚。通过形态学特征进行判断是对小体鲟识别的传统方法，但是这些形态学特征的可塑性强，受环境影响大，具有人为的主观倾向性，且存在丰富的近缘物种，近缘种间的形态差异细微，所以传统的形态学特征识别方法存在识别困难与识别错误的问题。采用DNA技术鉴定动物物种是物种识别方法中最为热门也是发展最快的分子技术，快速进化并呈母系遗传的线粒体DNA是种群遗传学和进化遗传学的理想研究对象。目前，鱼类物种的分子检测主要集中CoⅠ基因，小体鲟鱼与其它近源物种的CoⅠ基因序列相似度在95％以上，序列之间存在着一定的差异。实时荧光PCR是DNA技术鉴定中快捷高效的技术之一，指在DNA扩增反应中，通过荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法，研究利用实时荧光PCR对小体鲟鱼进行物种识别及在小体鲟鱼的物种保护及系统发育研究等领域均具有重大意义。
技术实现要素：
本发明提供一种小体鲟特异性检测体系及该特异性检测体系的应用方法。本发明可以检测出来自动物样品的微量DNA，完全区分小体鲟的基因与其它鱼类基因，检测灵敏度高，方法快速，易操作。本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种小体鲟实时荧光PCR物种特异性检测引物和检测体系，其中所述的引物序列是：上游引物SEQIDNO.1：5’-ACTTCTCCTATTATCGCTACC-3’；下游引物SEQIDNO.2：5’-TAGAATTAGAATATACACCTCTGG-3’；进一步地，所述小体鲟物种实时荧光PCR特异性检测体系还包括由其他试剂所组成的反应体系如下表1：表1小体鲟物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应体系其中，PremixExTaq购自于大连宝生物工程有限公司(商品货号：RR820)进一步地，所述小体鲟物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数如下表2：表2小体鲟物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数对所述的小体鲟物种实时荧光PCR特异性检测体系的应用，利用GreenI与双链DNA非特异性结合的特性，监测每一PCR反应的荧光强度，以检测反应体系中的DNA扩增产物。进一步地，所述小体鲟物种进行实时荧光PCR特异性检测方法为：采用实时荧光PCR特异性检测体系扩增小体鲟的CoⅠ基因，以PremixExTaqDNA聚合酶进行PCR反应，利用GreenI与双链DNA结合后发出荧光的特性，检测反应体系中的GreenI与DNA结合后发出的荧光，达到检测PCR产物扩增量目的。通过设计小体鲟物种特异性引物，从而引发特异性扩增，通过荧光信号的收集处理，通过荧光信号的收集处理，获得特异性扩增曲线。本发明特异性引物设计合理，用于小体鲟物种检测，特异性好，检测灵敏度高。采用本方法检测小体鲟动物成分结果显示，采用小体鲟物种特异性检测引物进行实时荧光PCR扩增小体鲟的CoⅠ基因，会产生一条特异性扩增曲线，即经过实时荧光PCR分析，即可将小体鲟成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。附图说明图1.相似序列的物种分布情况，其中，方框内的物种为小体鲟所在的位置；图2.引物的特异性分析，如图所示只有小体鲟(Acipenserruthenus)的物种能和所设计的引物完全互补结合，没有检验到完全匹配的其它物种，证明引物的特异性较好；图3.引物PCR扩增的电泳检测结果图，图中：M、DL2000marker1、小体鲟2、小体鲟3、史氏鲟4、俄罗斯鲟5、欧鳇6、西伯利亚鲟7、空白对照。图4.小体鲟实时荧光PCR的溶解曲线检测结果图，图中：1、小体鲟2、小体鲟3、史氏鲟4、俄罗斯鲟5、欧鳇6、西伯利亚鲟7、达氏鲟8、空白对照。图5.小体鲟与其他鲟形目海洋鱼类的实时荧光PCR特异性检测结果图，图中：1、小体鲟2、史氏鲟3、俄罗斯鲟4、欧鳇5、西伯利亚鲟6、达氏鲟7、空白对照。图6.灵敏度分析结果图，图中：1、25ng/μL扩增结果；2、5ng/μL扩增结果；3、1ng/μL扩增结果；4、0.2ng/μL扩增结果；5、0.04ng/μL扩增结果；6、0.01ng/μL扩增结果；7、空白对照。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。本发明下述具体实施例中所涉及的实验方法如无特殊说明，均为实验室常规方法，所用的试剂或药品，如无特殊说明，均由常规方法制备或者可由商业途径获得，其中所用空白对照为水。实施例1荧光PCR特异性检测引物序列的设计1.小体鲟相近物种CoⅠ基因的分析登录NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，以Acipenserruthenus及CoⅠ为关键词在nr数据库中进行搜索，再次在nr数据库中进行BlastN程序进行相似序列的搜索，返回的相似序列的物种分布情况如图1所示，其中方框内的物种为小体鲟所在的位置，并将所有的相似序列下载存盘。2.小体鲟物种特异性检测引物的设计将下载的序列进行序列的相似性分析和序列性分析，在序列的差异处设计特异性引物。3.小体鲟物种特异性检测引物的特异性分析将设计好的引物在NCBI中，利用primerblast程序选择nr数据库，进行引物的特异性分析，如图2结果所示：在返回的结果中，只有小体鲟(Acipenserruthenus)的物种能和所设计的引物完全互补结合，没有检验到完全匹配的其它物种，证明引物的特异性较好。4.小体鲟物种特异性检测引物合成在宝生物公司合成小体鲟物种特异性检测引物1对，其序列为：上游引物SEQIDNO.1：5’-ACTTCTCCTATTATCGCTACC-3’；下游引物SEQIDNO.2：5’-TAGAATTAGAATATACACCTCTGG-3’；5.小体鲟DNA的提取采用DNA提取试剂盒(购于宝生物公司)提取小体鲟(购自于大连国富水产食品有限公司)模板DNA，用微量分光光度计检测提取小体鲟模板DNA的浓度为100ng左右。6.小体鲟CoⅠ基因的克隆及测序验证琼脂糖凝胶电泳检测：以合成的特异性引物PCR扩增小体鲟的CoⅠ基因后，以2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示(如图3所示)，经琼脂糖凝胶电泳检测后会分别产生166bp的特异性电泳条带，电泳效果最好，PCR扩增效率最高。片段的切胶回收：采用宝生物公司的DNA片段回收试剂盒将目的条带回收及纯化，操作过程按试剂盒附带的说明书进行。回收片段的连接、克隆及测序：回收片段与克隆载体pMD-19T连接，转化，经菌液PCR检测，阳性菌株送上海生物工程有限公司进行序列测定，确定所克隆的目的片段的序列信息。序列验证：测序结果采用NCBI的BlastN程序通过序列比对进行验证，验证结果显示，所克隆的片段为小体鲟的CoⅠ基因片段。实施例2实时荧光PCR特异性检测体系的应用小体鲟物种实时荧光PCR特异性检测体系的应用，即利用所述小体鲟物种实时荧光PCR特异性检测体系扩增小体鲟的CoⅠ基因，对小体鲟物种进行实时荧光PCR特异性检测，具体步骤如下：表3小体鲟物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应体系小体鲟物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数如下表4：表4小体鲟物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数采用小体鲟实时荧光PCR特异性检测组合物进行实时荧光PCR扩增小体鲟的CoⅠ基因时，以PremixExTaqDNA聚合酶进行PCR反应，利用GreenI与双链DNA结合后发出荧光，检测反应体系中的GreenI与DNA结合后发出的荧光，通过设计小体鲟物种特异性引物，从而引发特异性扩增，通过荧光信号的收集处理，获得特异性扩增曲线，如图4及图5所示，证明了所设计引物进行PCR扩增的有效性及特异性的结果。实施例3特异性检测利用所述小体鲟物种实时荧光PCR特异性检测体系进行小体鲟的物种成分实时荧光PCR特异性检测小体鲟等鲟形目样品，采用DNA提取试剂盒提取各待测样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所提取的模板DNA的浓度为50ng/μL，分别按照上述步骤4中所述反应体系及反应参数进行PCR扩增，产生的30个循环以下的特异性扩增曲线即为小体鲟，其他样品在30个循环以后出现扩增曲线或没有扩增曲线，此方法可以准确的对小体鲟的成分进行鉴定，具有很好的特异性，如图5所示。实施例4灵敏度检测采用DNA提取试剂盒提取阳性样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所提取的模板DNA梯度稀释，制备成25ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL、0.04ng/μL、0.01ng/μL6个浓度梯度样品，分别按照上述步骤3中所述反应体系及反应参数进行实时荧光PCR扩增，以确定本标准方法的检测灵敏度，结果如图6所示，所产生特异性扩增曲线即为小体鲟，当DNA浓度≥0.04ng/μL时均可以特异扩增，即该标准方法的检测灵敏度为0.04ng/μL。此方法可以准确的对小体鲟的成分进行鉴定，具有很好的灵敏度。以上内容是结合优选技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明的具体实施仅限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出简单的推演及替换，都应当视为本发明的保护范围。