本发明涉及工业微生物技术领域及生物药物领域，具体涉及一种海洋小单孢菌发酵生产Rakicidins类化合物的方法。
背景技术：
抗肿瘤药物市场近年来高速增长，2014年抗癌药市场全球销售额1000亿美元；到2018年，抗癌药市场将达到1470亿美元，复合增长率11.6％，研发抗癌药将获利巨大。缺氧是恶性实体肿瘤的特征之一，缺氧与肿瘤的血管新生、侵袭转移、放化疗抵抗和预后不良等密切相关。低氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)是缺氧效应调控中最为关键的核转录调控因子。HIF-1在实体肿瘤组织内选择性持续高表达，下游关键调控基因与肿瘤的发生发展密切相关,如促进血管生成、细胞存活、抑制肿瘤细胞凋亡、代谢重塑以及pH稳态的调节。正是由于不同时空下癌症细胞所处的环境中氧含量的不同，由此激活的促进肿瘤生长的信号通路通常不会在正常组织中被诱导，所以乏氧信号通路成为潜在的治疗靶点。以HIF-1为靶点的特异性小分子抑制剂也成为肿瘤缺氧效应调控药物研发的重点。
Rakicidin A和B因为其15元环脂肽结构中含1个稀有罕见的4-氨基-2,4-戊二烯酸辛酯并有抗肿瘤细胞活性而受到关注[McBrien K D,Berry R L,Lowe S E et al.Rakicidins,New Cytotoxic Lipopeptides from Micromonospora sp.Fermentation,Isolation and Characterization[J].J Antibiot,1995,48:1446]。Yamazaki(2007)研究发现Rakicidin A具有卓越的乏氧选择性抗肿瘤细胞活性，在乏氧条件下抗结肠癌HCT-8细胞活性是常氧条件下的17.5倍[Yamazaki Y,Kunimoto S,Ikeda D.Rakicidin A:a hypoxia-selective cytotoxin[J].Biol Pharm Bull.2007,30(2):261-5.]。Takeuchi(2011)首次报道Rakicidin A乏氧条件下能诱导髓性慢性白血病干细胞的凋亡[Takeuchi M,Ashihara E,Yamazaki Y,et al.Rakicidin A effectively induces apoptosis in hypoxia adapted Bcr-Abl positive leukemic cells[J].Cancer Sci.2011,102(3):591-6.]。该化合物抗乏氧肿瘤细胞及抗CSC的作用机制虽不清楚，但Rakicidin A已被许多同行认为是一个极富开发前景的抗乏氧肿瘤细胞及抗CSC药物。
发明人课题组2006年在国内首先报道从微生物代谢产物中分离到Rakicidin A和B，并对Rakicidin B(FW523-3)的有关生物学活性进行了初步研究(江红，林如，郑卫，等.海洋青铜小单孢菌FIM02-523产生的脂肽类化合物FW523的分离鉴别和生物学活性[J].中国抗生 素杂志,2006,31(5):267-270；江红，林如，程元荣.海洋小单孢菌来源的轻快菌素B FW523-3的体外抗肿瘤活性.中国抗生素杂志,2008,33(9):531；Xie JJ,Zhou F,Li EM,Jiang H,Du ZP,Lin R,Fang DS,Xu LY.FW523-3,a novel lipopeptide compound,induces apoptosis in cancer cells.Mol Med Rep.2011，4(4):759-63)。
目前关于Rakicidins类化合的发酵生产工艺研究报道较少。Kimberly D.Mcbrien等报道了Rakicidins类化合物的发酵及分离纯化，但其仅提供基本的摇瓶工艺且发酵周期较长(8天)，未提供适合工业化生产的工艺[McBrien K D,Berry R L,Lowe S E et al.Rakicidins,New Cytotoxic Lipopeptides from Micromonospora sp.Fermentation,Isolation and Characterization[J].J Antibiot,1995,48:1446-52]。国内仅发明人江红前期报道在筛选新免疫抑制剂的过程中，从海洋青铜小单孢菌Micromonospora chalcea sp.FIM 02-523发酵液中提取到Rakicidins类化合物包括Rakicidins A和Rakicidins B(江红，林如，郑卫，程元荣，海洋青铜小单孢菌FIM 02-523产生的脂肽类化合物FW523的分离鉴别和生物学活性。中国抗生素杂志，2006,31(5)：267-270)。但是所述的仅是摇瓶的基本发酵培养基及培养方法，用于样品的累积，其发酵水平低下，不能应用于大规模发酵生产。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中Rakicidins类化合物发酵效价低，无法达到工业化生产的技术要求的缺陷。公开了一种Rakicidins类化合物的微生物发酵生产工艺，提供一种操作简单、成本低廉、可以工业化规模生产，最高总发酵效价达到600mg/L左右。并且可以通过发酵条件的优化有效的控制发酵液中各组分的比例及含量。
本发明将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.12132的小单孢菌进行固体斜面培养、摇瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐发酵培养，后处理即得，在发酵罐发酵开始阶段就补加氨基酸。所述补加的氨基酸选自缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸中的一种或几种。添加缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸的浓度优选0.05～0.3％、0.05～0.3％、0.05～0.3％，本发明所述的百分比均为重量百分比。
本发明公开了一个小单孢菌菌株，简称：FIM02-523，分类命名：Micromonospora sp.FIM02-523。其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCCNo.12132。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏日：2016年2月18日。从福建省莆田海滩土中获得。
所述的Rakicidins类化合物优选下列任一结构的化合物：
其中Rakicidin A和B为已知化合物，Rakicidin B1为新化合物。
优选的制备方法包括：
a.固体斜面培养：保藏编号为CGMCC NO.12132的小单孢菌接种于固体斜面，后于30-37℃恒温培养10-15天，后常温保藏；
b.摇瓶种子培养：在500ml三角瓶中装入种子培养基80ml，121℃消毒30分钟，冷却后接种孢子悬液，于摇床230rpm，28-35℃培养48小时；
c.种子罐培养：将摇瓶培养好的种子合并，以种子罐装液量的1-5％接种到种子罐培养基中，200-300rpm，通气量1:1vvm，28℃，培养48小时；
d.发酵罐发酵培养：将种子罐培养好的种子以5-10％的接种量接种到发酵罐中，培养时间为72-100小时，发酵转速控制200-400rpm、通气量控制0.08-1.2VVM，在发酵过程中添加缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸中的一种或几种作为发酵的前体物。
e.后处理，即得。
优选添加氨基酸的浓度为：缬氨酸为0.05-0.3％、甘氨酸为0.05-0.3％、甲硫氨酸为0.05-0.3％。添加时间优选为发酵开始的0-36小时，分次或一次性补加。发酵过程添加 0.05～0.3％缬氨酸可以提高Rakicidin A的组分含量；发酵过程添加0.1～0.3％甘氨酸可以提高Rakicidin B的组分含量；发酵过程添加0.1～0.3％甲硫氨酸可以提高Rakicidin B1及B的组分含量。
其中固体培养基的组分及各组分的百分含量优选：可溶性淀粉2、L-天冬素0.05、KNO3 0.1、K2HPO4·3H2O 0.05、NaCl 0.05、MgSO4·7H2O 0.05、CaCO3 0.1、琼脂1.5，pH7.5。
摇瓶种子培养步骤中种子培养基的组分及各组分的重量百分含量优选为：可溶性淀粉1～3、葡萄糖0.5～1.0、酵母粉1～2、蛋白胨0.5～2.0、MgSO4·7H2O 0.05、FeSO4·7H2O 0.005、CuSO4·5H2O 0.005、CoCl2·6H2O 0.0005、CaCO3 0.1～0.3，由自来水配制，pH,7.0～7.5。
发酵培养基的组分及各组分的重量百分含量优选为：可溶性淀粉3～6、蔗糖0.5～2.0、黄豆饼粉1.0～3.0、酵母粉1.0～3.0、MgSO4·7H2O 0.04、FeSO4·7H2O 0.005、CuSO4·5H2O 0.005、CoCl2·6H2O 0.0005、CaCO3 0.3～0.6，自来水配制，pH 7.5。
各培养基更优选的组分及百分含量为：
种子培养基：可溶性淀粉2.0、葡萄糖1.0、酵母粉2.0、蛋白胨1.0、MgSO4·7H2O 0.05、FeSO4·7H2O 0.005、CuSO4·5H2O 0.005、CoCl2·6H2O 0.0005、CaCO3 0.1～0.3，自来水配制，pH,7.0～7.5。温度优选28～32℃。
发酵培养基：可溶性淀粉5.0、蔗糖1.0、黄豆饼粉3.0、酵母粉1.0、MgSO4·7H2O 0.04、FeSO4·7H2O 0.005、CuSO4·5H2O 0.005、CoCl2·6H2O 0.0005、CaCO3 0.5，自来水配制，pH 7.5。温度优选32℃。
本发明通过培养基的优化及发酵过程条件的控制，特别是在发酵开始阶段的氨基酸的补加，在20-1000L发酵罐的发酵实验中，海洋小单孢菌(Micromonosporasp.FIM02-523)发酵产生Rakicidins类化合物的总效价达到600mg/L左右，有利于Rakicidins类化合物的提取工作，可以满足工业化需求。
从表1中实施例与对照例发酵结果可以看出，本发明通过添加氨基酸后明显提高了产品的效价。
表1不同氨基酸添加条件对Rakicidins类化合物各组分产量的影响
对照例1
将固体斜面保藏的海洋小单孢菌(Micromonosporasp.FIM02-523)孢子刮取后制成菌悬液接种到摇瓶一级种子培养中，在28℃，220rpm，培养48小时。
种子培养基配方(％)：可溶性淀粉2.0，葡萄糖1.0，酵母粉2.0，蛋白胨1.0，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.005,CuSO4·5H2O 0.005,CoCl2·6H2O 0.0005，CaCO30.1～0.3，自来水配制，pH,7.0～7.5；28～32℃。
之后按照5％的接种量接种于20L发酵罐(实际装液量15L)中进行发酵,28℃培养,起始转速为200rpm，48小时后调为350rpm至发酵结束约96-120小时。罐压0.03-0.05Mpa，通气量为1:1vvm。
发酵培养基为：可溶性淀粉5.0，蔗糖1.0，黄豆饼粉3.0，酵母粉1.0，MgSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.005,CuSO4·5H2O 0.005,CoCl2·6H2O 0.0005，CaCO3 0.5，自来水配制，pH 7.5；32℃。发酵过程通过HPLC检测发酵液中Rakicidins类化合物的含量，最终发酵效价为50mg/L，其中Rakicidin A含量为15mg，Rakicidin B1含量为10mg，Rakicidin B含量为35mg。
具体实施方式
实施例1
将固体斜面保藏的海洋小单孢菌(Micromonosporasp.FIM02-523)孢子刮取后制成菌悬液接种到摇瓶一级种子培养中，在28℃，220rpm，培养48小时。
种子培养基配方(％)：可溶性淀粉2.0，葡萄糖1.0，酵母粉2.0，蛋白胨1.0，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.005,CuSO4·5H2O 0.005,CoCl2·6H2O 0.0005，CaCO30.1～0.3，自来水配制，pH,7.0～7.5；28～32℃。
之后按照5％的接种量接种于20L发酵罐(实际装液量15L)中进行发酵,28℃培养,起始转速为200rpm，48小时后调为350rpm至发酵结束约96-120小时。罐压0.03-0.05Mpa，通气量为1:1vvm。
发酵培养基为：可溶性淀粉5.0，蔗糖1.0，黄豆饼粉3.0，酵母粉1.0，MgSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.005,CuSO4·5H2O 0.005,CoCl2·6H2O 0.0005，CaCO3 0.5，自来水配制，pH 7.5； 32℃。发酵开始24小时后一次性补加发酵液体积含量0.1％缬氨酸。发酵过程通过HPLC检测发酵液中Rakicidins类化合物的含量，最终发酵效价为190mg/L，其中Rakicidin A含量为120mg/L，Rakicidin B1含量为20mg/L，Rakicidin B含量为50mg/L。
实施例2
发酵过程基本状况同实施例1，仅区别在发酵开始24小时后一次性补加发酵液体积含量0.2％甲硫氨酸。发酵过程通过HPLC检测发酵液中Rakicidins类化合物的含量，最终发酵效价为270mg/L，其中Rakicidin A含量为50mg/L，Rakicidin B1含量为120mg/L，RakicidinB含量为110mg/L。
实施例3
发酵过程基本状况同实施例1，仅区别在发酵开始24小时后一次性补加发酵液体积含量0.3％甘氨酸。发酵过程通过HPLC检测发酵液中Rakicidins类化合物的含量，最终发酵效价为570mg/L，其中Rakicidin A含量为140mg/L，Rakicidin B1含量为80mg/L，Rakicidin B含量为350mg/L。
实施例4
发酵过程基本状况同实施例1，仅区别在发酵开始24小时后一次性补加发酵液体积含量0.1％甲硫氨酸及0.2％甘氨酸。发酵过程通过HPLC检测发酵液中Rakicidins类化合物的含量，最终发酵效价为600mg/L，其中Rakicidin A含量为100mg/L，Rakicidin B1含量为180mg/L，Rakicidin B含量为320mg/L。
实施例5
将固体斜面保藏的海洋小单孢菌(Micromonosporasp.FIM02-523)孢子刮取后制成菌悬液后接种到摇瓶一级种子培养基中，在28℃，220rpm，培养48小时。之后按照5％的接种量接种于20L种子罐(实际装液量15L)中进行二级发酵,28℃培养,转速为300rpm，，罐压0.03～0.05Mpa，通气量为1:1vvm，培养48小时左右。
摇瓶种子及种子罐配方：可溶性淀粉2.0，葡萄糖1.0，酵母粉2.0，蛋白胨1.0，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.005,CuSO4·5H2O 0.005,CoCl2·6H2O 0.0005，CaCO30.1～0.3，自来水配制，pH,7.0～7.5；28～32℃。
按照8％接种量接种于100L发酵罐(实际装液量为75L)，通气量为1:1vvm，起始转速为200rpm，24小时后根据溶氧下降逐步提高转速至400rpm。在发酵开始24小时后一次性补加发酵液体积含量0.3％甘氨酸。
发酵培养基为：可溶性淀粉5.0，蔗糖1.0，黄豆饼粉3.0，酵母粉1.0，MgSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.005,CuSO4·5H2O 0.005,CoCl2·6H2O 0.0005，CaCO3 0.5，自来水配制，pH 7.5； 32℃；所述培养基组分中的百分数为质量分数。发酵过程通过HPLC检测发酵液中Rakicidins类化合物的含量，最终发酵效价为540mg/L，其中Rakicidin A含量为130mg/L，Rakicidin B1含量为90mg/L，Rakicidin B含量为330mg/L。
实施例6
将固体斜面保藏的海洋小单孢菌(Micromonosporasp.FIM02-523)孢子刮取后制成菌悬液后接种到摇瓶一级种子培养基中，在28℃，220rpm，培养48小时。
之后按照5％的接种量接种于50L种子罐(实际装液量35L)中进行二级发酵,28℃培养,转速为300rpm，，罐压0.03～0.05Mpa，通气量为1:1vvm，培养48小时左右。
摇瓶种子及种子罐配方：可溶性淀粉2.0，葡萄糖1.0，酵母粉2.0，蛋白胨1.0，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.005,CuSO4·5H2O 0.005,CoCl2·6H2O 0.0005，CaCO30.1～0.3，自来水配制，pH,7.0～7.5；28～32℃。
按照5％接种量接种于1000L发酵罐(实际装液量为720L)，通气量为1:1vvm，起始转速为120rpm，24小时后根据溶氧下降逐步提高转速至250rpm。在发酵开始24小时后一次性补加发酵液体积含量0.3％甘氨酸。
发酵培养基为：可溶性淀粉5.0，蔗糖1.0，黄豆饼粉3.0，酵母粉1.0，MgSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.005,CuSO4·5H2O 0.005,CoCl2·6H2O 0.0005，CaCO3 0.5，自来水配制，pH 7.5；32℃；所述培养基组分中的百分数为质量分数。发酵过程通过HPLC检测发酵液中Rakicidins类化合物的含量，最终发酵效价为570mg/L，其中Rakicidin A含量为110mg/L，Rakicidin B1含量为80mg/L，Rakicidin B含量为380mg/L。
实施例7
RakicidinB1的制备
步骤一：小单孢菌菌株FIM02-523的发酵培养条件参照文献(江红，林如，郑卫，等.海洋青铜小单孢菌FIM02-523产生的脂肽类化合物FW523的分离鉴别和生物学活性[J].中国抗生素杂志,2006,31(5):267-270)。
步骤二：将步骤一所得的FIM02-523发酵液通过4500rpm离心15min后，获得菌丝渣，把获得的菌丝渣用2倍体积的无水甲醇或乙醇过夜浸泡2次，将含有酒精的菌丝渣再次以4500rpm离心15min后将上清液合并，得到发酵提取液。
步骤三：HP20大孔树脂吸附柱层析(径高比为1:5～1:10，装柱体积1.5-2.5L)：采用的发酵提取液(40-60L)以50％-55％的酒精浓度，流速为40ml/min进行上柱吸附；吸附完全后，以浓度60％-80％的酒精进行梯度洗脱，用HPLC检测洗脱液1，合并含有Rakicidin B1的相同组分(30L)。
步骤四：步骤三洗脱液进行NM200树脂吸附柱层析(径高比为1:2～1:10，装柱体积1-2L)：将步骤三洗脱液以50％-55％的酒精浓度，流速为40ml/min，进行上柱吸附；吸附完全后，以浓度55％-80％的酒精进行梯度洗脱，用HPLC检测洗脱液2，合并含有Rakicidin B1的相同组分(25L)。
步骤五：步骤四洗脱液2经过一倍体积水稀释后，用等体积乙酸乙酯萃取2次，减压浓缩，得粗品。
步骤六：将步骤五获得的粗品，用甲醇溶解，进行中压反相C18柱层析(径高比1:3～1:10)，流速30ml/min，以浓度为60％-90％乙腈-水梯度洗脱，分部收集，用HPLC检测收集液，合并相同组分。
所述的小单孢菌FIM02-523于2016年2月藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12132。
化合物Rakicidin B1:白色无定型粉末。溶于氯仿、甲醇、DMSO，不溶于水。高分辨质谱(HR-ESI-MS)显示其分子离子峰[M+H]+为621.1175，推断其分子式为C33H56N4O7，不饱和度为8。13CNMR和DEPT135显示该分子含有33个碳信号，包括5个季碳(δC 172.6,172.4,169.2,167.6,165.9)，4个双键碳[包含一个sp2亚甲基碳，两个sp2次甲基碳(δC 138.4,118.8)]，6个sp3次甲基碳[包含两个连氧碳原子(δC 78.0,72.4)]，13个sp3亚甲基碳和5个甲基碳原子(δC 36.5,19.1,15.4,13.2,11.2)。1HNMR显示该化合物有4个双键质子[δH 6.87(1H,d,J＝15.0Hz),6.16(1H,d,J＝15.0Hz),5.44(1H,s),5.32(1H,s)],5个可交换质子[δH8.88(1H,s),8.05(1H,d,J＝9.9Hz),7.31(1H,s),7.28(1H,s),5.66(1H,d,J＝6.0Hz)],5个甲基质子[δH 2.95(3H,s),1.05(3H,d,J＝7.0Hz),0.93(3H,d,J＝6.9Hz),0.83(3H,t,J＝7.0Hz),0.81(3H,d,J＝6.7Hz)]。所有的氢质子通过HSQC谱1H–13C相关进行指认。1H–1H COSY相关谱和质子的耦合常数显示该化合物含有4个独立的自旋耦合体系：NH-2–C-2–C-3–OH-3,C-9–C-10,C-31–C-14–C-15–C-16(C-32)–C-17–C-18和C-26–C-27–C-28(C-33)–C-29–C-30。结合1H–1H COSY和HMBC可知，H-2与C-1/C-5相关，H-3与C-4相关，OH-3与C-2/C-3相关，Ha-6与C-5/C-7相关，H3-7与C-6/C-8相关，H-9与C-8/C-11相关，H-10与C-8/C-11相关，Hb-12与C-10/C-11相关，H-15与C-1相关，H3-30与C-28/C-29相关，H3-31与C-13/C-14/C-15相关，H3-32与C-15/C-16/C-17相关，以及H3-33与C-27/C-28/C-29相关，氢和碳的化学位移列于下表：