一种高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法与流程

本发明可用于发酵食品(酱油、豆豉、腐乳等)中优良发酵菌种的筛选，属于食品发酵
技术领域：
，特别涉及一种高产蛋白酶霉菌菌株快速简便的筛选方法。
背景技术：
：霉菌中的米曲霉、毛霉等在发酵食品中应用广泛，其丰富的蛋白酶能将原料中的蛋白质降解成多肽及氨基酸，提高蛋白质的消化利用率；特别是能产生一些呈味氨基酸及小分子肽，赋予发酵食品良好的风味。可以说，米曲霉及毛霉等霉菌是发酵食品生产中的重要菌种。酱油、豆豉、腐乳等发酵食品生产中所用的米曲霉、毛霉等菌种应具有较高的蛋白酶酶活，发酵食品生产中菌种的蛋白酶酶活直接影响了原料的利用率、氨基氮含量等重要指标，因此，筛选获得高蛋白酶活力的霉菌菌株对于酱油等发酵豆类食品生产尤为重要。目前，常用的蛋白酶活力筛选方法为酪素平板法，通过测定菌株在平板上分泌蛋白酶产生的透明圈与菌落直径的比值(K值)来筛选高蛋白酶酶活菌株(参见图1)，从图1中可以看出，这种方法由于霉菌在生长过程中菌落形态不规则、边缘不清晰，透明圈直径较难测定，导致K值的测定结果准确度较低；且各菌之间的K值很小，难以反应各菌之间产酶能力的差距(参见图3)，从图3中可以看出实际测得的酶活大小与K值的大小相关性很差，这说明传统的琼脂-酪素双层平板法对曲霉的筛选结果不可靠。为准确进行筛选，不得不在制曲培养后采取福林-酚法进行蛋白酶酶活的测定。福林-酚法测定蛋白酶酶活需要采用三角瓶制曲、培养、绘制标准曲线，结果虽然准确，但器材及试剂药品用量大，而且所需时间长，方法繁琐，耗时耗力。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是，克服以上
背景技术：
中提到的不足和缺陷，提供一种方便操作、准确率高、工作量小及成本低的高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种高产蛋白酶霉菌菌株(特别优选米曲霉菌株或毛霉菌株)的快速筛选方法，包括以下步骤：(1)菌种活化：将需要进行筛选的多种或多株霉菌菌株分别接种于霉菌生孢子培养基斜面，然后恒温培养；(2)制备高蛋白酶霉菌定向筛选平板：在灭菌干燥后的平皿中先倒入下层对照培养基，待其冷却凝固后再倒入上层筛选培养基；(3)放置并固定筛选装置：在上层筛选培养基待凝过程中放置多个同等大小的无菌小杯，培养基凝固后无菌小杯固定；(4)待测霉菌孢子悬液制备及活化：无菌生理盐水洗下步骤(1)中培养好的霉菌孢子，无菌擦镜纸过滤除菌丝后接入孢子活化液体培养基活化，再调整孢子浓度；(5)待测霉菌测定前培养：等量吸取步骤(4)制备的各霉菌活化孢子悬液，分别注入上述步骤(2)制得的高蛋白酶霉菌定向筛选平板的各无菌小杯中(其中一个无菌小杯中可注入等量的无菌水作对照)，接种完成后置于恒温培养箱中培养；(6)待测霉菌蛋白酶酶活对比筛选：上述步骤(5)的培养完成后，量取高蛋白酶霉菌定向筛选平板上各无菌小杯周围形成的透明圈直径；根据透明圈直径大小确定各霉菌菌株蛋白酶活力大小，透明圈越大，无菌小杯中接种的霉菌菌株蛋白酶活力越大。本发明通过将无菌小杯与改良酪素培养基配合使用，利用不同规格的培养皿同时进行多种或多株高蛋白酶霉菌菌株的筛选，方法简便，省时省力，极大地提高了高蛋白酶霉菌初筛的准确度和效率，在选育筛选高产蛋白酶霉菌菌株的运用中具有重要意义。上述高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法，优选的，所述步骤(1)中，选用的霉菌生孢子培养基主要由100～110g/L玉米粉、150～160g/L马铃薯、20～25g/L蔗糖、15～20g/L琼脂配制而成，pH自然；马铃薯需去皮、切块、煮熟处理，煮熟时间不低于30min，再用纱布过滤，利用滤液配制培养基；121℃灭菌20min。上述高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法，优选的，所述步骤(2)中，所述的下层对照培养基为纯琼脂培养基；所述的上层筛选培养基为改良酪素培养基。霉菌产生的蛋白酶能够水解酪素从而在改良酪素培养基形成透明圈，但因酪素培养基颜色为白色以及培养皿底部不平整等原因，不利于观察和测量透明圈的大小，所以添加纯琼脂培养基为下层平板，有利于透明圈的观察和测量，提高结果的准确性。上述高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法，更优选的，所述改良酪素培养基中添加去氧胆酸钠作为霉菌菌丝蔓延抑制剂。更优选的，所述改良酪素培养基的具体配方浓度包括：干酪素3～6g/L、去氧胆酸钠1.0～2.0g/L、磷酸二氢钾0.36g/L、硫酸锰0.5g/L、氯化锌0.014g/L、磷酸氢二钠1.07g/L、氯化钠0.16g/L、硫酸亚铁0.002g/L、氯化钙0.002g/L、琼脂粉15～20g/L；pH6.5～7.0；121℃灭菌20min。上述改进的方案中，上层筛选培养基中优选添加去氧胆酸钠，以抑制霉菌菌丝的蔓延，提高测量结果的准确性。本发明还进一步限定了去氧胆酸钠的最适添加量，我们的研究表明，去氧胆酸钠添加量过大会导致霉菌无法正常生长，透明圈不明显；而去氧胆酸钠添加量过小则抑制菌丝效果不明显，菌丝蔓延出无菌小杯，影响透明圈的测量。上述高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法，优选的，所述步骤(1)中，恒温箱中培养的温度为28±0.1℃，培养时间为48h。上述高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法，优选的，所述步骤(3)中，筛选装置无菌小杯采用牛津杯或直径1cm、高1cm的玻璃小管，无菌小杯在Φ60mm、Φ90mm、Φ120mm、Φ150mm的培养皿中的放置数量分别为3～4个、4～5个、11～12个、18～19个；无菌小杯放置的位置为距离皿底1～2mm处。本发明采用的无菌小杯以牛津杯为优选；在本
技术领域：
，我们从未见于将其在霉菌菌株蛋白酶活力筛选领域中进行运用，这显然不是本领域人员容易想到的。上述高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法，优选的，所述步骤(4)中，所述孢子活化液体培养基主要由浓度10～12g/L发芽大麦、3.0～5.0g/L玉米浆、15～20g/L葡萄糖配制而成，pH自然；121℃灭菌15min。本发明的主要原理为：通过将无菌小杯与改良酪素培养基配合使用，限制了菌丝长到杯外，使得其形成的透明圈形状规则、边缘清晰，方便测量；在小杯中再注入等体积、等浓度的孢子悬液，将实验定量化，显著提高了检测筛选结果的准确程度；此外，本发明的方法可以在菌种诱变后代替制曲后福林-酚法测酶活的筛选方法，快速完成大量突变株的筛选，有效地减少诱变菌株的筛选工作量及筛选成本。与现有技术相比，本发明的优点在于：1、本发明方法中的无菌小杯及上层筛选培养基中优选添加的去氧胆酸钠都会限制霉菌的蔓延，阻止菌丝长到杯外，使得其形成的透明圈形状规则、边缘清晰；同时，通过添加纯琼脂培养基为下层平板，使得透明圈清晰可见，方便测量；2、在本发明方法设计的无菌小杯中注入等体积、等浓度的孢子悬液，将实验定量化，提高了筛选结果的准确程度；从图4中可以看出，采用福林-酚法实际测得的酶活大小与本发明高蛋白酶霉菌定向筛选平板法测得的透明圈大小相关性较好，说明高蛋白酶霉菌定向筛选平板法测得的透明圈大小在一定程度上可以代替福林-酚法对霉菌进行筛选，且筛选结果准确度高。3、本发明的方法可以在菌种诱变后代替制曲后福林-酚法测酶活的筛选方法，减少诱变菌株的筛选工作量及筛选成本。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为现有琼脂-酪素双层平板法筛选高蛋白酶酶活米曲霉图。图2为本发明高蛋白酶霉菌定向筛选平板法筛选高蛋白酶酶活米曲霉图。从图中可以看出透明圈直径清晰、边缘规则，因此筛选结果明显好于常规琼脂-酪素双层平板法。图3为现有琼脂-酪素双层平板法与福林-酚法筛选高蛋白酶酶活米曲霉对比图。图4为本发明高蛋白酶霉菌定向筛选平板法与福林-酚法筛选高蛋白酶酶活米曲霉对比图。图5为本发明实施例1中高蛋白酶霉菌定向筛选平板法筛选高产蛋白酶米曲霉的结果。图6为本发明对比例1中采用常规的琼脂-酪素双层平板法筛选高产蛋白酶米曲霉的结果。图7为本发明对比例2中采用常规福林-酚法筛选高产蛋白酶米曲霉的结果。图8为本发明实施例2中高蛋白酶霉菌定向筛选平板法筛选高产蛋白酶毛霉的结果。图9为本发明对比例3中采用常规的琼脂-酪素双层平板法筛选高产蛋白酶毛霉的结果。图10为本发明对比例4中采用常规福林-酚法筛选高产蛋白酶毛霉的结果。具体实施方式为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。实施例1：一种高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法，即采用高蛋白酶霉菌定向筛选平板法筛选高蛋白酶酶活米曲霉，具体包括以下步骤：(1)菌种活化：将需要进行筛选的100株米曲霉菌株分别转接到霉菌生孢子培养基的斜面上，放置于恒温箱中28±0.1℃培养48h。选用的霉菌生孢子培养基配方为玉米粉100g/L、马铃薯150g/L、蔗糖25g/L、琼脂20g/L，pH自然；马铃薯需要进行去皮、切块、煮熟处理，煮熟时间不低于30min，再用纱布过滤，利用滤液配制培养基；121℃灭菌20min。(2)制备高蛋白酶霉菌定向筛选平板：准备6套规格为Φ150mm的培养皿，灭菌干燥，在平皿中先倒入下层对照培养基，厚度约为2mm，待其冷却凝固后再倒入上层筛选培养基，厚度约为3mm。选用的下层对照培养基为纯琼脂培养基。选用的上层筛选培养基为改良酪素培养基，具体的配方为干酪素4g/L、去氧胆酸钠1.5g/L、磷酸二氢钾0.36g/L、硫酸锰0.5g/L、氯化锌0.014g/L、磷酸氢二钠1.07g/L、氯化钠0.16g/L、硫酸亚铁0.002g/L、氯化钙0.002g/L、琼脂粉20g/L，pH6.5；121℃灭菌20min。(3)放置并固定筛选装置：在上层筛选培养基待凝过程中放置18个同等大小的无菌牛津杯，放置的位置为距离皿底2mm处，培养基凝固后无菌牛津杯固定。(4)待测霉菌孢子悬液制备及活化：无菌生理盐水洗下步骤(1)中培养好的米曲霉孢子，无菌擦镜纸过滤除菌丝后接入孢子活化液体培养基，160r/min、28℃振荡活化6h，再将孢子浓度调整为106个/mL。选用的孢子活化液体培养基是由10g/L发芽大麦、3.0g/L玉米浆、20g/L葡萄糖配制而成，pH自然；121℃灭菌15min。(5)待测霉菌测定前培养：吸取10μL步骤(4)制备的米曲菌活化孢子悬液，分别注入上述步骤(2)制得的高蛋白酶霉菌定向筛选平板的各牛津杯中，其中一个牛津杯中注入等量的无菌水作对照，接种完成后置于28℃的恒温培养箱中培养2d。(6)待测霉菌蛋白酶酶活对比筛选：上述步骤(5)的培养完成后，量取高蛋白酶米曲霉定向筛选平板上各牛津杯周围形成的透明圈直径(参见图2)，选取出高蛋白酶米曲霉定向筛选平板法结果最好的9株菌，结果如表1、图5所示；根据透明圈直径大小确定各霉菌菌株蛋白酶活力大小，透明圈越大，即对应的米曲霉菌株蛋白酶活力越大。表1：高蛋白酶霉菌定向筛选平板法筛选米曲霉结果综合评价：本实施例的筛选步骤简单，操作方便，所需的时间约为2.5天，筛选结果准确度可达到90％以上，筛选100株菌仅需要准备6套规格为Φ150mm的培养皿，适合用于高产蛋白酶霉菌的快速筛选。对比例1：采用常规的琼脂-酪素双层平板法筛选高蛋白酶酶活米曲霉，具体操作如下：(1)菌种活化：将待测米曲霉菌株接种于PDA培养基斜面，28℃恒温培养48h。(2)制备琼脂-酪素双层平板：准备100套规格为Φ90mm的培养皿，灭菌干燥，在平皿中先倒入纯琼脂培养基，厚度约为2mm；待其冷却后再倒入酪素培养基，厚度约为3mm，制备得到琼脂-酪素双层平板：选用的纯琼脂培养基的制备方法的制备方法同上述本实施例1的步骤(2)；选用的酪素培养基的制备方法与上述本实施例1的步骤(2)中的区别在于没有添加去氧胆酸钠。(3)制备孢子悬液：用无菌生理盐水洗下步骤(1)中已经培养好的霉菌孢子，无菌擦镜纸过滤除菌丝。(4)接种：取1mL孢子悬液涂布于琼脂-酪素双层平板。(5)培养：同上述本实施例1的步骤(5)。(6)筛选对比：上述步骤(5)培养完成后，对上述本实施例1中选取的9株菌进行测定，量取琼脂-酪素双层平板上各透明圈直径及菌落直径，计算K值(透明圈直径与菌落直径)结果如表2、图6所示。表2：现有琼脂-酪素双层平板法K值筛选米曲霉结果菌种编号1-11-21-31-41-51-61-71-81-9K值1.671.711.332.181.641.541.801.671.80综合评价：虽然此法的所需的时间较短(约为2.5天)，但步骤复杂，工作量大，且结果准确度低，筛选100株菌至少需要准备100套规格为Φ90mm的培养皿，不适合用于快速筛选高产蛋白酶霉菌。对比例2：采用常规的福林-酚法测米曲霉蛋白酶酶活，具体操作如下：按照中华人民共和国国家标准SB/T10317-1999进行测定。(1)制曲：准备100份制曲培养基置于三角瓶中，在冷却且物料松散的培养基中接种孢子悬液，每个三角瓶中孢子数为7.7×106个，于32℃恒温培养36h，定时翻曲。选用的制曲培养基的制备方法包括以下步骤：将豆粕、小麦、麸皮以7:2:1的比例混匀装瓶(50g干料/三角瓶)，然后和水润湿(加水量与原料的质量比为90％)，0.1～0.12MPa灭菌1～1.5h。(2)剩余步骤按照中华人民共和国国家标准SB/T10317-1999进行。(3)测定结果：对上述本实施例1中选取的9株菌进行测定，如表3、图7所示。表3：福林-酚法测米曲霉蛋白酶酶活结果综合评价：虽然筛选结果准确度高，但步骤复杂，工作量巨大且原料耗费大，所需的时间长(约5天)，筛选100株菌至少需要准备100瓶上述曲料并测定，不适合用于快速筛选高产蛋白酶霉菌。从以上实施例1和对比例1、2的结果对比可以看出，采用常规琼脂-酪素双层平板法的透明圈直径较难测定，导致K值的测定结果准确度较低，难以反应各米曲霉菌之间产酶能力的差距，实际测得的酶活大小与K值的大小相关性很差。而采用福林-酚法实际测得的酶活大小与本发明高蛋白酶霉菌定向筛选平板法测得的透明圈大小相关性较好，说明本发明的改良高蛋白酶霉菌定向筛选平板法测得的透明圈大小在一定程度上可以代替福林-酚法对米曲霉菌株进行筛选，且筛选结果准确度高。此外，相比于常规琼脂-酪素双层平板法和福林-酚法，高蛋白酶霉菌定向筛选平板法在工作量、耗材、耗时上都具有比较明显的优势；因此高蛋白酶霉菌定向筛选平板法是一种能够适用于米曲霉菌株的快速筛选的方法。实施例2：一种高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法，即采用改良高蛋白酶霉菌定向筛选平板法筛选高蛋白酶酶活毛霉，本实施例的具体操作步骤与实施例1基本相同，只是筛选的对象由米曲霉替换为毛霉，筛选菌数为30株。采用10个规格为Φ90mm的培养皿，每个培养皿放置4个无菌牛津杯(其中一个牛津杯中可注入等量的无菌水作对照)。选取出高蛋白酶霉菌定向筛选平板法结果最好的9株菌，结果筛选结果如下表4、图8所示。表4：高蛋白酶霉菌定向筛选平板法筛选毛霉结果对比例3：采用常规的琼脂-酪素双层平板法筛选高蛋白酶酶活毛霉，具体操作过程与对比例1基本相同，对上述本实施例2中选取的9株菌进行测定，结果如下表5、图9所示。表5：现有琼脂-酪素双层平板法K值筛选毛霉结果菌种编号2-12-22-32-42-52-62-72-82-9K值1.121.851.570.930.760.900.850.640.68对比例4：采用常规的福林-酚法测米曲霉蛋白酶酶活，具体操作与对比例2基本相同，对上述本实施例2中选取的9株菌进行测定，结果如下表6、图10所示。表6：福林-酚法测毛霉蛋白酶酶活结果从以上实施例2和对比例3、4的结果对比可以看出，采用常规琼脂-酪素双层平板法的透明圈直径较难测定，导致K值的测定结果准确度较低，难以反应各毛霉菌株之间产酶能力的差距，实际测得的酶活大小与K值的大小相关性很差。而采用福林-酚法实际测得的酶活大小与本发明高蛋白酶霉菌定向筛选平板法测得的透明圈大小相关性较好，说明本发明的高蛋白酶霉菌定向筛选平板法测得的透明圈大小在一定程度上可以代替福林-酚法对毛霉菌株进行筛选，且筛选结果准确度高。此外，相比于常规琼脂-酪素双层平板法和福林-酚法，高蛋白酶霉菌定向筛选平板法在工作量、耗材、耗时上都具有比较明显的优势；因此高蛋白酶霉菌定向筛选平板法是一种能够适用于毛曲霉菌株的快速筛选的方法。当前第1页1 2 3