一株吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH5及其应用的制作方法

本发明涉及一株吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH5及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术：

吡虫啉是一种新型的硝基亚甲基类的高效内吸性广谱杀虫剂，属新烟碱类药物，是烟碱型乙酰胆碱受体的作用体，目前在农业生产中已广泛使用，属低毒类杀虫剂，对蜜蜂的毒性为高毒。2002年，意大利北部和法国一些地区在使用吡虫啉过程中出现蜜蜂大量消失的现象，新烟碱类药物属于神经毒素，可以阻碍蜜蜂及其他昆虫大脑中的感受器接收神经信号。

2012年木村黑田（Kimura-Kuroda）等人在PLoS One杂志上发表的一篇科学论文，提出吡虫啉的暴露可能会对哺乳动物神经系统的发育产生影响。欧盟食品安全局（EFSA）针对此论文分析发现，吡虫啉可能会对人类发育中的神经系统造成影响。在EFSA审查发现吡虫啉对蜜蜂有害之后，近两年欧盟已限制该药在一些作物上的使用（《Agrow》No.665，p6）。建立针对吡虫啉的快速、准确和灵敏的检测方法很有必要。

目前检测吡虫啉色谱法应用最为广泛，包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用(GC-MS)、液质联用 (LC-MS)、超临界流体色谱(SFC)、毛细管电泳(CE)等的仪器方法，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂，成本高，时间长，不能实现大量样品的快速检测，因此建立快速简便的吡虫啉检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对吡虫啉具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立吡虫啉的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12015。

吡虫啉单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.12015的吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH5分泌产生。

所述吡虫啉单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中吡虫啉残留的分析检测。

本发明提供的吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH5的制备基本步骤为：

1）半抗原的合成：

将吡虫啉原药1(2 g，7.82 mmol），巯基丙酸（1.66 g，2 eq），Cs2CO3（25.5g，10 eq）混悬于己二酸二甲酯（30 mL）中，120℃下反应16 h，冷至室温，加入四氢呋喃（50 mL）后过滤，所得固体粗品（30g）加入少量水中，prep-HPLC纯化，最后得到100mg半抗原IMPA。用液质联用分析法进行鉴定与分析；

2）完全抗原IMPA-KLH的制备：称取2.5mg IMPA，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）5mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）3mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解(称为A液)，室温搅拌反应8 h。取匙孔血蓝蛋白KLH 1mL(5mg/mL)，加入等体积硼酸缓冲溶液（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物IMPA-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

3）小鼠的免疫：吡虫啉完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。最后一次用吡虫啉完全抗原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；

4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH5；

5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。

吡虫啉完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫（100μg/只）用完全弗氏佐剂，多次加强免疫（50μg/只）用不完全弗氏佐剂，最后一次用吡虫啉完全抗原（25μg/只，不含佐剂）冲击免疫。取高效价低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对吡虫啉具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.3 ng/mL），可实现对水、果蔬、谷物中吡虫啉残留量的检测，为食品中吡虫啉残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

本发明的有益效果：本发明提供的细胞株YH5分泌的单克隆抗体，对吡虫啉具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.3 ng/mL），可实现对水、果蔬、谷物中吡虫啉残留量的检测，为食品中吡虫啉残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

生物材料样品保藏：一株吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2016年1月20日，保藏编号为CGMCC No.12015。

附图说明

图1 YH5单克隆抗体对吡虫啉的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将吡虫啉完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对吡虫啉有较好特异性和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例1 杂交瘤细胞株YH5的制备

（1）半抗原的合成：将吡虫啉原药1 (2g，7.82mmol），巯基丙酸（1.66g，2eq），Cs2CO3（25.5g，10eq）混悬于DMA（30mL）中，120℃下反应16 h，冷至室温，加入四氢呋喃（50mL）后过滤，所得固体粗品（30g）加入少量水中，prep-HPLC纯化，最后得到100mg半抗原IMPA，用液质联用分析法进行鉴定。

（2）完全抗原的合成：称取2.5mg IMPA，EDC 5mg，NHS 3mg，用300μL无水DMF溶解(称为A液)，室温搅拌反应8h。取KLH 1mL(5 mg/mL)，加入等体积BB溶液（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物IMPA-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。

（3）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取吡虫啉完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲击免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。

（4）细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡 5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1-4×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5 min。离心（800 rpm，8 min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。

（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用吡虫啉为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞孔进行抑制效果测定。选择对吡虫啉标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株YH5。

（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

6.1包被：将包被原IMPA-KLH用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1µg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；

6.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

6.3封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h，洗涤后烘干备用；

6.4加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h；

6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37 ℃避光反应15min；

6.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450值。

用ic-ELISA测定单克隆抗体吡虫啉的IC50为：0.3 ng/mL，说明对吡虫啉有很好的灵敏度，可用于吡虫啉免疫分析检测。

溶液的配置：碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05 % 吐温20的PBS；

TMB显色液：A液：Na2HPO4^.12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB，显色液，现用现混。

表1.YH5单克隆抗体的交叉反应率

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