一种用于精神分裂症诊断的circRNA标志物、试剂盒及基因芯片的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于精神分裂症诊断的circRNA标志物、试剂盒及基因芯片。

背景技术：

精神分裂症(schizophrenia,SZ)是精神科主要病种，也是最为严重的精神障碍之一，多起病于青壮年，常有特殊的思维、知觉、情感和行为等多方面的障碍和精神活动与环境的不协调，世界人口患病率约1％，精神分裂症以幻觉、妄想、精神运动性兴奋、思维形式障碍等阳性症状和(或)以情感迟钝、情感淡漠、社交退缩、意志减退等阴性症状为主要临床特征，对患者的认知、情感、行为和社会功能造成严重损害。精神分裂症有较高的致残率、复发率和残留精神症状，给家庭和社会带来沉重的经济和照顾负担，并对社会的安定、和谐造成一定的威胁。

经过几十年的探索，精神分裂症的发病机制虽然依旧不是很清楚，但已有大量研究表明，基因遗传是精神分裂症的主导因素，目前，关于精神分裂症遗传学方面的研究，关注microRNA、lncRNA在精神分裂症发病机制中的调控作用，目前，对microRNA表达水平与精神分裂症关系的研究较多。

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类通常由一个以上外显子构成的环形RNA分子，以往，对circRNA的了解主要来自病毒、类病毒和拟病毒，Salzman等的研究表明，数以百计的人类基因表达circRNA，Jeck等在人类成纤维细胞中检测到了高达25000多种的circRNA，Memczak等则从RNA-seq数据中鉴定出约2 000种人类circRNA。根据目前的研究,circRNA具有如下特征:大多数定位于细胞质,且序列高度保守；比线性RNA更稳定,不易被降解；许多circRNA表达水平与线性RNA的表达水平相当，一些circRNA的表达水平甚至超过它们的线性异构体10倍；大多数来自蛋白质编码基因的外显子；一些circRNA拥有miRNA应答元件，能与miRNA相互作用；大部分是非编码RNA。

研究表明，circRNA作为稳定高效的miRNA抑制剂。相比仅含成串单一MRE的miRNA海绵，circRNA含有多种MRE，可以同时抑制不同的miRNA，发挥网络调控的作用。从现有研究看，miRNA广泛参与精神分裂症的病理、基因表达等调控过程，对精神分裂症发生、发展、预后等产生极大的影响。那么，circRNA的表达水平可能与精神分裂症存在一定的关联。

精神分裂症病因复杂，病理机制不明确，缺乏特异性的生物标记物，造成临床诊断缺乏客观指标，增加了临床误诊率，因此，探讨精神分裂症诊断和疗效观察的特异性生物标记物cirRNA，对于精神分裂症的诊断、治疗、预防复发等均具有重要的意义和价值。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种用于精神分裂症诊断的circRNA标志物。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于精神分裂症诊断的circRNA标志物，所述标记物包括hsa_circRNA_101835、hsa_circRNA_101836、hsa_circRNA_102101、hsa_circRNA_102315、hsa_circRNA_103102、hsa_circRNA_103704和hsa_circRNA_104597七种circRNA的组合。所述hsa_circRNA_101835、hsa_circRNA_101836、hsa_circRNA_102101、hsa_circRNA_102315、hsa_circRNA_103102、hsa_circRNA_103704和hsa_circRNA_104597为相关数据库中的RNA代号，可以在数据库中检索得到。

在本发明的第二方面，提供了一种精神分裂症诊断试剂盒，其能够测定血液中的hsa_circRNA_101835、hsa_circRNA_101836、hsa_circRNA_102101、hsa_circRNA_102315、hsa_circRNA_103102、hsa_circRNA_103704和hsa_circRNA_104597这七种circRNA的含量。

在本发明的一个优选例中，上述试剂盒含有hsa_circRNA_101835、hsa_circRNA_101836、hsa_circRNA_102101、hsa_circRNA_102315、hsa_circRNA_103102、hsa_circRNA_103704和hsa_circRNA_104597的引物和探针。

在本发明的一个优选例中，还提供了hsa_circRNA_101835、hsa_circRNA_101836、hsa_circRNA_102101、hsa_circRNA_102315、hsa_circRNA_103102、hsa_circRNA_103704和hsa_circRNA_104597在制备精神分裂症诊断试剂盒中的应用。

在本发明的一个优选例中，上述hsa_circRNA_101835的正向引物如SEQ ID NO.1所示，hsa_circRNA_101835的反向引物如SEQ ID NO.2所示；hsa_circRNA_101836的正向引物如SEQ ID NO.3所示，hsa_circRNA_101836的反向引物如SEQ ID NO.4所示；hsa_circRNA_102101的正向引物如SEQ ID NO.5所示，hsa_circRNA_102101的反向引物如SEQ ID NO.6所示；hsa_circRNA_102315的正向引物如SEQ ID NO.7所示，hsa_circRNA_102315的反向引物如SEQ ID NO.8所示；hsa_circRNA_103102的正向引物如SEQ ID NO.9所示，hsa_circRNA_103102的反向引物如SEQ ID NO.10所示；hsa_circRNA_103704的正向引物如SEQ ID NO.11所示，hsa_circRNA_103704的反向引物如SEQ ID NO.12所示；hsa_circRNA_104597的正向引物如SEQ ID NO.13所，hsa_circRNA_104597的反向引物如SEQ ID NO.14所示。

在本发明的一个优选例中，上述hsa_circRNA_101835的探针序列如SEQ ID NO.15所示；hsa_circRNA_101836的探针序列如SEQ ID NO.16所示；hsa_circRNA_102101的探针序列如SEQ ID NO.17所示；hsa_circRNA_102315的探针序列如SEQ ID NO.18所示；hsa_circRNA_103102的探针序列如SEQ ID NO.19所示；hsa_circRNA_103704的探针序列如SEQ ID NO.20所示；hsa_circRNA_104597的探针序列如SEQ ID NO.21所示。

在本发明的第三方面，提供了一种精神分裂症诊断基因芯片，包括探针和固相支持物组成，所述探针序列如SEQ ID NO.15～21所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯膜。

在本发明的第四方面，提供了一种用于评估抗精神分裂症药物疗效的circRNA标志物，所述标记物为hsa_circRNA_100364、hsa_circRNA_101835、hsa_circRNA_101836、hsa_circRNA_102315、hsa_circRNA_103704、hsa_circRNA_104597六种circRNA的组合。

在本发明的第五方面，提供了一种评估抗精神分裂症药物疗效的试剂盒，其能够测定血液中的hsa_circRNA_100364、hsa_circRNA_101835、hsa_circRNA_101836、hsa_circRNA_102315、hsa_circRNA_103704、hsa_circRNA_104597六种circRNA的含量。

在本发明的一个优选例中，还提供了hsa_circRNA_100364、hsa_circRNA_101835、hsa_circRNA_101836、hsa_circRNA_102315、hsa_circRNA_103704、hsa_circRNA_104597六种circRNA在制备评估抗精神分裂症药物疗效的试剂盒中的应用。

在本发明的一个优选例中，上述试剂盒含有hsa_circRNA_100364、hsa_circRNA_101835、hsa_circRNA_101836、hsa_circRNA_102315、hsa_circRNA_103704、hsa_circRNA_104597的引物及探针。

在本发明的一个优选例中，上述hsa_circRNA_100364的正向引物如SEQ ID NO.22所示；hsa_circRNA_100364的反向引物如SEQ ID NO.23所示；hsa_circRNA_104597的正向引物如SEQ ID NO.24所示，hsa_circRNA_104597的反向引物如SEQ ID NO.25所示；hsa_circRNA_101835的正向引物如SEQ ID NO.1所示，hsa_circRNA_101835的反向引物如SEQ ID NO.2所示；hsa_circRNA_101836的正向引物如SEQ ID NO.3所示，hsa_circRNA_101836的反向引物如SEQ ID NO.4所示；hsa_circRNA_102315的正向引物如SEQ ID NO.7所示，hsa_circRNA_102315的反向引物如SEQ ID NO.8所示；hsa_circRNA_103704的正向引物如SEQ ID NO.11所示，hsa_circRNA_103704的反向引物如SEQ ID NO.12所示。

在本发明的一个优选例中，上述hsa_circRNA_100364的探针序列如SEQ ID NO.26所示；hsa_circRNA_104597的探针序列如SEQ ID NO.27所示；hsa_circRNA_101835的探针序列如SEQ ID NO.15所示；hsa_circRNA_101836的探针序列如SEQ ID NO.16所示；hsa_circRNA_102315的探针序列如SEQ ID NO.18所示；hsa_circRNA_103704的探针序列如SEQ ID NO.20所示。

所述诊断试剂盒和评估抗精神分裂症药物疗效的试剂盒中还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl₂和DEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品；在本发明的一个优选例中，选用了β-Actin作为内参。

上述人类精神分裂症诊断试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是定量PCR扩增试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的；所述的试剂例如(但不限于)：阴性对照品、阳性对照品；还可以包括荧光定量PCR反应板、PCR反应板封口膜等。

可使用本领域技术人员所熟知的多种技术(例如定量或半定量RT-PCR，RNA印迹分析，溶液杂交检测等)测定相关circRNA在精神分裂症患者和健康人群中的水平；在本发明的具体实施方案中，使用了定量PCR的方法。

在本发明的第六方面，提供了一种评估抗精神分裂症药物疗效的基因芯片，包括探针和固相支持物，所述探针序列如SEQ ID NO.15～16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.26～27所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯膜。

本发明的有益效果在于：circRNA具有高度稳定性、特异性和敏感性，本发明提供了精神分裂症生物标记物和预测抗抑郁药物疗效的circRNA标记物。经临床验证之后，具有较高的特异性和敏感值，有较高的诊断参考价值，circRNA作为精神分裂症特异性生物标记物将带来精神分裂症诊断及治疗的革命性改变。

1、精神分裂症的诊断将不依靠主观经验判断，而是可以通过circRNA表达水平这种客观指标检查，进行确诊，提高诊断准确率，简化诊断过程；

2、有望通过circRNA模拟物和拮抗物(修饰寡核苷酸)改变特定circRNA表达水平能够使异常的基因调控网络和信号通路正常化，进而治疗精神分裂症；

3、有望通过检测特定circRNA表达水平对抗焦虑药物的疗效进行预测；

4、有望通过检测特定circRNA表达水平对精神分裂症患者转归及预后情况进行预测；

5、有望通过circRNA模拟物和拮抗物对特定精神分裂症某种特定症状进行针对性治疗。

附图说明

图1为RT-PCR分析证实精神分裂症病人与对照者差异性表达circRNA图。

图2为circRNA的联合ROC曲线图。

具体实施方式

一、研究对象

病例组：2014年8月至2015年10月于解放军第102医院门诊以及精神科病房连续收治的病人。入组标准：①符合美国精神疾病诊断和统计手册第4版(DSM-IV)精神分裂症诊断标准；②首发病人或入组前3个月未服抗精神病药物。排除标准：①患有其他精神疾病；②患有脑外伤等躯体或神经系统疾病；③有酗酒或药物滥用史；④入组前1个月内有输血史；⑤入组前3个月内使用过无抽搐电休克治疗者(MECT)。共入组102者，其中男性44例，女性58例，年龄岁。

对照组：来自解放军第102医院工作人员、健康体检人员，除一例性别不匹配外，其余与病例组年龄、性别和民族一一匹配，最大限度排除了性别、年龄和民族等因素带来的误差。纳入标准:①无精神疾病家族史；②近1个月内无重大创伤事件；③近1月内无输血史。共入组103，其中男性49人，女性54人，年龄分布在岁。

本研究获得解放军第102医院医学伦理委员会批准，所有受试者或受试家属(监护人)均签署知情同意书。

在开展研究前，首先对参加本课题的精神专科医师和研究生进行培训。采用精神分裂症阳性和阴性症状量表(PANSS)、大体评定量表(GAS)、临床疗效总评量表(CGI)在病例入组前、药物治疗4周后、药物治疗8周后分别进行评估。由两位精神科主治医师根据DSM-IV-TR对患者进行诊断，如果出现不一致情况，则请一位精神科主任医师共同讨论后确定诊断。

入组时记录一般情况(姓名、性别、年龄、民族、文化程度、职业、收入水平、婚姻状况、药物成瘾史及精神疾病家族史等)。同样，记录正常对照组一般情况。

二、研究方法

①评估工具

精神分裂症阳性和阴性症状量表(PANSS)：19世纪末，由Hughlings-Jackson首先提出，经后人整理，于1987年正式发表，现已广泛应用。阳性与阴性症状量表是为评定不同类型精神分裂症症状的严重程度而涉及和标准化的评定量表，由简明精神病量表和精神病理评定量表合并改编而成，共有33个条目，其中阳性症状条目7条，阴性症状条目7条，一般精神病理量表16项，复合量表3项。

大体评定量表(GAS)：大体评定量表是评价各类精神疾病症状的量表，在同类量表中是应用最广泛的一种。本研究使用的是美国心理卫生研究所(NIMH)1976年的Spitzer版本，共有10级评定分(1～10分)，根据患者临床症状进行评定。总分越高，说明病情越轻。本研究中使用GAS量表的中文版本进行评估，该版本经信效度检验分析，达到心理测量学标准。

临床疗效总评量表(CGI)：临床疗效总评量表由WHO设计，用于国际精神疾病试点调查(IPSS)的研究，现用以评定临床疗效，适用于任何精神科治疗和研究对象。量表分为病情严重程度(severity of illness，SI)，疗效总评(global improvement，GI)和疗效指数(efficacy index，EI)三个分量表。本研究中使用CGI量表的中文版本进行评估，该版本经信效度检验分析，达到心理测量学标准。本研究中使用疾病严重程度分(severity of illness，SI)和疗效总评分(global improvement，GI)进行统计分析。

②资料收集

入组时记录一般情况(姓名、性别、年龄、民族、文化程度、职业、收入水平、婚姻状况、药物成瘾史及精神疾病家族史等)。由3名精神科主治医师或医师使用汉密尔顿焦虑量表(HAMA)和临床疗效总评量表(CGI)于用药前、用药4周及用药8周以上对病例组被试进行评定。评定前，所有参与研究人员进行统一培训，统一方法学等，保证施测过程标准化。其中HAMA使用总分和因子分统计，CGI使用疗效总评分(global improvement,GI)统计。

③药物干预

在102例病例中，随机选取33例进行临床药物干预随访观察。对其采用每日服用奥氮平(剂量范围5～20mg)或利培酮(剂量范围2～6mg)或齐拉西酮(剂量范围40～140mg)和奎硫平(剂量范围100～800mg)口服治疗。

④主要试剂和耗材

LowInput Quick-Amp Labeling Kit，one-color(24*)(Agilent，货号：5190-2305)；Gene Expression Wash Pack(Agilent，5188-5327)；Gene Expression Hybridization Kit(5188-4242)；RNA Spike In Kit，one-color(5188-5327)；荧光定量PCR引物：Custom Plus TQMN RNA Assays(美国ABI公司)；荧光定量PCR试剂：TaqMan通用混合试剂盒Ⅱ(美国ABI公司，货号：4440047)；反转录试剂盒：QuantiTect Rev.Transcription Kit(QIAGEN，货号：205311)。

⑤主要仪器

扫描仪(仪器来源：Affymetrix，型号：Scanner 3000)；杂交炉(仪器来源：Affymetrix，型号：Hybridization Oven 640)；洗涤工作站(仪器来源：Affymetrix，型号：Fluidics Station 450)；2100(仪器来源：Agilent，型号：G2939A)；2100振荡器(仪器来源：Agilent，型号：9600)；NanoDrop(Thermo，2000)；PCR仪(ABI，9700)；离心机(eppendorf，5418)；浓缩仪(eppendorf，5301)；离心机(其林贝尔，LX-200)；离心机-1(其林贝尔，LX-300)；振荡器-1(其林贝尔，GL-88B)；磁力搅拌器(其林贝尔，GL-3250B)；金属浴-2(博日，HB-100)；金属浴-3(博日，CHB-100)；电热恒温培养箱(精宏实验设备，XMTD-8222)；冰箱(荣事达，BCD-265F)；ABI9700型PCR仪(美国ABI公司)；天美CT14RD型台式高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)；NanoDrop1000超微量紫外分光光度计(附电脑1套)(美国Thermo公司)；ABI 7900HT Fast Read-Time PCR System(附电脑1套)(美国ABI公司)；WH-2微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；JS-400A恒温金属浴(上海培清科技有限公司)；DK-8D数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台(苏净净化设备有限公司)；-81℃超低温冰箱(日本三洋公司)。

⑥RNA提取和circRNA芯片筛查

所有被试者使用EDTA抗凝管采肘静脉血5ml，在3000×g的转速下分别离心10分钟。用重力梯度离心机将外周血单核淋巴细胞分离出来后，将其置于冻存管中，-80℃保存备用。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)从单核淋巴细胞中提取总RNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。并用NanoDrop ND-1000(Thermo Scientific,Delaware,ME,USA)进行扩增。血样取自5名SZ患者和5名健康体检人员，用来进行Arraystar Human circRNA Array analysis。RNA质检合格后，样本的标记、芯片的杂交以及洗脱参照芯片标准流程。首先，总RNA反转录成双链cDNA，再进一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA。标记好的cRNA和芯片Arraystar Human circRNA Array(8x15K,Arraystar,USA)杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)扫描得到原始图像。具体步骤：(1)样本裂解，离心沉淀PBMC细胞，加入1ml TRIZOL试剂反复吹打使细胞裂解，室温孵育5分钟，使样本充分裂解。(2)每1ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，室温孵育3分钟。4℃，12000×g离心15分钟。离心后RNA全部被分配于水相中，体积约为加入的TRIZOL试剂的60％。(3)将水相转移到新离心管中，每个样品匀浆时加入1ml TRIZOL试剂的此时加0.5ml的异丙醇。颠倒混匀后室温孵育10分钟，4℃，12000×g离心10分钟。此时RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成白色沉淀。(4)去上清，每1ml TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.5ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃，7500×g离心5分钟。(5)去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀10分钟。(注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。)加入30ul无RNA酶的水用枪反复吹打几次，55℃孵育10分钟，测浓度，存于-80℃。

⑦逆转录聚合酶链式反应

对芯片筛查结果中的10种差异表达明显的circRNA进行后续的RT-PCR验证。并用102名精神分裂症患者和103名健康对照组的血液样本验证这9种差异性表达的circRNA。按照RNA逆转录试剂盒(TaqMan RNA反转录试剂盒，美国ABI公司)说明书进行逆转录反应，circRNA荧光扩增探针是由Invitrogen company(USA)合成的。实时荧光定量PCR按照TaqMan试剂盒(TaqMan通用混合试剂盒II，美国ABI公司)说明书进行。

⑧统计学处理

使用χ2检验分析MDD组和NC组的性别差异；使用两独立样本t检验分析MDD组与NC组间年龄的差异。采用Mann-Whitney秩和检验病例组(SZ)和对照组(NC)之间circRNA的相对表达量。Univariate repeated measures analysis of variance用来检测三次(用药前，用药4周及8周后)之间circRNA的表达差异分析。全部数据用DataAssist v3.0Statistical Package for Social Sciences for Windows 20.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)统计软件进行统计分析。

三、研究结果

1、基因芯片分析发现，9种circRNAs在精神分裂症病例组与对照组之间存在显著差异，其中8种上调，1种下调，见表1。

表1病例组芯片中筛查中差异表达的9种circRNA

2、PCR验证分析发现，精神分裂症与对照组的circRNA表达水平比较，神分裂症患者外周血hsa_circRNA_102101、hsa_circRNA_102315、hsa_circRNA_104597、hsa_circRNA_101835、hsa_circRNA_101836的表达水平显著下调；hsa_circRNA_103102、hsa_circRNA_103704的表达水平显著上调。结果见表2和图1。

表2病例组与对照组lncRNA表达水平比较(△Ct±SD)

3、30例精神分裂症患者各circRNA在抗抑精神病药治疗前、治疗4周、治疗8周的比较中，发现hsa_circRNA_102315、hsa_circRNA_100364、hsa_circRNA_103704、hsa_circRNA_101835、hsa_circRNA_101836治疗后表达水平显著下降，hsa_circRNA_104597表达水平显著上调，见表3。

表3抗精神病药物治疗前后circRNAs的ΔCT差异比较(△Ct±s)

4、对circRNA精神分裂症诊断价值的接受者操作特征曲线(ROC)分析发现，AUC为0.885(95％CI:0.837-0.933)，敏感度为：0.648，特异度为：0.753，见图2。

四、用于精神分裂症诊断的基因芯片的制备

采用序列如SEQ ID NO.14～21所示的七种探针，该部分的核苷酸的平均长度为32个碱基，它的3’端与共有序列1的5’端相接，在它的5’端接上15个碱基组成的无义链寡核苷酸(“CCGGCCTATTATGGCCGG”)，使得每一条核苷酸探针的总长度约为50个碱基。将每条探针的3’端进行氨基修饰，使之能够和玻璃板上的聚合硅发生共价反应从而固定到芯片表面。然后将这些探针分别在用于制备芯片的玻璃板上平行点样三次。

芯片的制备采用涂有有机硅的Corning GAPS-2玻璃板(目录号：#40003，供应商：Corning Inc.，美国)为支持材料，并用SmartArray点样机(型号SmartArray-48，供应商：CapitalBio Corp，中国)点样，每个探针点的直径为150μm，相邻探针点中心间的距离为240μm，点完探针样品后让玻璃片在室温下干燥24小时，然后按下述方法清洗掉未共价结合的DNA和点样缓冲液：把玻璃片放在一个烧杯中并在烧杯中放一个搅拌子，在25℃用0.2％的SDS洗涤两次，每次5分钟，然后在50℃用蒸馏水洗两次，每次5分钟，再在25℃用0.1M四氢硼二钠溶液洗涤5分钟，用0.2％SDS洗涤三次，每次1分钟，用蒸馏水洗2次，每次1分钟。将玻璃片室温下于空气中彻底晾干后用于杂交检测。

本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。