本发明涉及酶或微生物的测定或检验方法，具体是一种加替沙星滴眼液无菌检查方法。
背景技术：
加替沙星滴眼液适用于敏感菌引起的急性细菌性结膜炎，主要成分为加替沙星。加替沙星是日本杏林公司首创的8-甲氧基喹诺酮类药物，对大部分革兰氏阳性菌的MIC90为0.1-0.78 mg/L，其活性是环丙沙星和氧氟沙星的2-16倍；对大部分革兰氏阴性菌的MIC90为0.025-0.39 mg/L，其活性与环丙沙星和氧氟沙星相当；对厌氧菌、支原体、衣原体的活性优于环丙沙星和氧氟沙星。
鉴于其强力而广泛的抗菌活性，无菌检查时必须使其抗菌活性消失，以保证样品中的微生物不受损伤，使检验结果准确可靠。喹诺酮可以与金属离子(Fe2+ ,Mg2+ ,Mn2+ )等络合,形成稳定的六元环络合物,掩盖它的活性基团,使抗菌活性消失。基于以上性质，现有的加替沙星无菌检查方法是采用冲洗液冲洗抑菌成分，并用硫酸锰溶液中和加替沙星活性基团的方式以消除其抑菌性。但是，该方法使用的冲洗液量大，对滤膜和可能存在于药液中的微生物造成损伤，影响检测结果的准确性；同时，该方法的试验时间过长，试验效率低，不符合现代化生产的要求。
技术实现要素：
本发明就是为了解决现有的加替沙星无菌检查方法冲洗液使用量大，试验时间长等问题，所提出的一种加替沙星滴眼液无菌检查方法。
本发明是按照以下技术方案实现的。
一种加替沙星滴眼液无菌检查方法，包括以下步骤：
Ⅰ.抽取少量冲洗液润湿无菌滤筒的薄膜后过滤加替沙星滴眼液；
Ⅱ.待加替沙星滴眼液全部过滤后，将冲洗液分次抽入，每次抽入总冲洗量的1/10，降低蠕动泵速，过滤冲洗滤膜；
Ⅲ.在抽入最后一份冲洗液之前，将无菌滤筒底部孔盖紧；然后抽取最后一份冲洗液，再抽入每份冲洗液1/10体积的中和剂，二者混匀后，对滤筒内壁进行冲洗，过滤；
Ⅳ.加入培养基在不同条件下进行培养，并检测结果。
所述冲洗液的成分为蛋白胨干粉和吐温-80，二者的质量份数比为1:1。
所述冲洗液的制备方法为：称蛋白胨干粉1份、吐温-80 1份，溶于1000份水中，调pH使灭菌后的pH值为7.1±0.2，115-121℃高压灭菌15-30分钟。
所述总冲洗量为500ml。
所述中和剂为0.1mol/L 硫酸锰溶液。
所述培养基为硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基；硫乙醇酸盐流体培养基于30-35℃培养14天，胰酪大豆胨液体培养基于20-25℃培养14天。
本发明获得了如下的有益效果。
本发明有效的解决了现有的加替沙星无菌检查方法冲洗液使用量大，试验时间长等问题。使用本发明所述方法进行加替沙星无菌检查，冲洗液用量由原来的800ml（陈莹，邢轶华等.加替沙星滴眼液无菌检查方法的建立.天津药学,2009,21(4):7-9）减小到现在的500ml，减小了37.5%，试验成本相应减少；中和剂加入时间前移至冲洗液后，加入时间更加科学；试验时间由原来的60min减少到25min，减少了58.3%，试验效率得到提高。所以，使用本发明所述检查方法，500ml冲洗液和5ml中和剂也可以起到降低抑菌成分的作用，并且节省冲洗液和冲洗时间，降低了试验繁琐程度，大大提高了试验效率；同时冲洗液用量减小也降低了损伤滤膜和原本存在于药液中微生物的可能性，提高了检测结果的准确性。本发明的试验方法科学，操作简单，试验结果准确，更加适合加替沙星滴眼液的无菌检查，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
一、 试验准备
1．供试品：加替沙星滴眼液
2. 菌种：金黄色葡萄球菌（CMCC（B）26003）
大肠埃希菌（CMCC（B）44102）
生孢梭菌（CMCC（B）64941）
枯草芽孢杆菌（CMCC（B）63501）
白色念珠菌（CMCC（F）98001）
黑曲霉菌（CMCC（F）98003）
以上标准菌株均购自中国药品生物制品检定所或天津市药品检验所。
3．培养基
4．培养基、冲洗液、中和剂配制方法
5．试验仪器
6. 菌悬液的制备：
a.增菌：分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，生孢梭菌于硫乙醇酸盐流体培养基中，30-35℃恒温箱培养18-24小时；接种白色念珠菌、黑曲霉菌于沙氏葡萄糖琼脂培养基中，20-25℃恒温箱，白色念珠菌培养24-48小时，黑曲霉菌5-7天，用3-5ml含0.05% 吐温80的0.9%无菌NaCl溶液将黑曲霉孢子洗脱，用管口带有无菌脱脂棉的毛细管收集孢子悬液于无菌试管中保存，备用。
b.菌液稀释：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的新鲜培养物用0.9%无菌NaCl溶液按10倍稀释，制成试验菌液；试验菌液每毫升含菌量小于100cfu。
c.新制备的菌悬液在室温条件下应在2小时内使用，2~8℃冷藏可保存24小时。
二、试验方法
1．薄膜制备
抽取少量冲洗液（使无菌滤筒中薄膜润湿即可），按每筒过滤量50ml（10瓶/筒）过滤供试品。待供试品全部过滤后，将冲洗液（500ml/筒）分次抽入，每次50ml/筒，轻轻振摇，过滤冲洗滤膜(降低泵速为30转/秒以充分润洗)。冲洗液分次抽入，在抽完第400ml时，将无菌滤筒底部孔盖紧，抽取50ml冲洗液，再抽入5ml 0.1mol/L 硫酸锰中和剂，关泵，将50ml冲洗液和5ml中和剂混匀，轻轻振摇（对滤筒内壁进行冲洗，避免死角），过滤，再抽取最后50ml冲洗液并加入小于100cfu试验菌，全量过滤，加入培养基至滤筒内，做为试验组。
另取一装有同体积培养基滤筒加入等量试验菌作为对照组。按规定温度培养3~5天。每一菌种同法操作。
2．培养
加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌的硫乙醇酸盐流体培养基滤筒，30-35℃恒温箱培养3-5天；加入枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌的胰酪胨大豆液体培养基滤筒，20-25℃恒温箱培养3-5天。
3．方法适用性试验结果
4．结论
以上适用性试验结果表明:试验组与对照组相比，试验菌生长良好，该试验方法及所用试验材料对试验菌生长无影响，故该试验方法可以用于该产品的无菌检查。
5．日常无菌检查方法确立
抽取少量冲洗液（使无菌滤筒中薄膜润湿即可），按每筒过滤量50ml过滤供试品。待供试品全部过滤后，将冲洗液（500ml/筒）分次抽入，每次50ml/筒，轻轻振摇，过滤冲洗滤膜(降低泵速为30转/秒以充分润洗)。冲洗液分次抽入，在抽完第450ml时，将无菌滤筒底部孔盖紧，抽取50ml冲洗液，再抽入5ml 0.1mol/L 硫酸锰中和剂，关泵，将50ml冲洗液和5ml中和剂混匀，轻轻振摇，对滤筒内壁进行冲洗，避免死角，过滤。分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基，硫乙醇酸盐流体培养基于30-35℃培养14天，胰酪大豆胨液体培养基于20-25℃培养14天。观察结果，结果见下表（表5）。