长链非编码RNA-APOC1P1-3基因及其在用于制备靶点标志物中的用途的制作方法

本发明涉及生物医学领域，具体涉及乳腺癌长链非编码RNA表达谱及APOC1P1-3基因，具体涉及长链非编码RNA-APOC1P1-3基因及其在用于制备靶点标志物中的用途，尤其是长链非编码RNA-APOC1P1-3基因及其在用于制备诊断和治疗乳腺癌新的靶点标志物中的用途。

背景技术：

乳腺癌是我国女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来已成为严重威胁我国女性健康和生命的头号杀手。研究显示，乳腺癌术后易发生转移，这在很大程度上与乳腺癌细胞的生长侵袭转移密切相关，因此，业内专业人员认为，研究乳腺癌诊断的分子标志物和基因治疗靶点对于患者争取宝贵治疗时机显得尤其重要。

早在1914年，Theoder Boveri提出恶性肿瘤细胞极性的改变和染色体不稳定性可能是由于中心体异常引起的，但这一推测一直未引起肿瘤研究者的关注。直至近些年，有关中心体在肿瘤发生、发展中显现的重要作用逐渐受到人们的关注。微管蛋白(tubulin)作为中心体的重要组成部分，参与染色体的运动、有丝分裂和细胞凋亡，其在肿瘤发生发展中的作用以及与恶性肿瘤的相关性成为近年研究的热点。有研究发现，中心体在多种肿瘤细胞系中发生异常，这不仅会引起非整倍体的形成，导致染色体不稳定性的发生，还会引起细胞质骨架紊乱，为细胞获得恶性表型提供遗传背景和环境条件(NiggEA.Centrosome aberrations:cause or consequence ofcancer progression Nat Rev Can,2002,2:815-825)。Dozier等(Dozier JH,Hiser L,Davis JA,et al.Beta class Ⅱ tubulin predominates in normal and tumor breast tissues[J].Breast Cancer Res,2003,5(5):R157-169)发现β-微管蛋白在正常乳腺组织和乳腺肿瘤组织中均占主要优势；还有研究发现(Papaconstantinou AD,Shanmugam I,Shan L,et al.Gene expression profiling in the mammary gland of rats treated with 7,12-dimethylbenz [a]anthracene [J].Int J Cancer,2006,118(1):17-24)，在化学致癌物7,12-二甲苯蒽作用六周后鼠乳腺组织中α-微管蛋白mRNA表达水平增高，表明微管动力学破坏及异常有丝分裂可能是乳腺癌进展过程中的重要事件。

现有研究发现长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)与人类各种重大疾病的发生发展密切相关，但迄今尚未见在乳腺癌中有关lncRNA及其调控作用以及LncRNA-APOC1P1-3的作用，特别是其与tubulin的关系的报道。

基于现有技术的基础，本申请的发明人拟通过乳腺癌组织和癌旁组织中lncRNA差异表达谱的研究，提供其中的一条长链非编码RNA-APOC1P1-3基因及其在用于制备诊断和治疗乳腺癌新的靶点标志物中的用途。在乳腺癌发病中的作用机制。

技术实现要素：

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供乳腺癌组织和癌旁组织中lncRNA差异表达谱；进一步提供其中一条长链非编码RNA-APOC1P1-3基因在在用于制备靶点标志物中的用途，尤其是该长链非编码RNA-APOC1P1-3基因在用于制备诊断和治疗乳腺癌新的靶点标志物中的用途。

本发明通过研究表明，APOC1P1-3能与tubulin结合，其影响乳腺癌细胞的凋亡进而在乳腺癌的发生发展中发挥作用。本发明能为乳腺癌的诊断和治疗提供新的靶点，对提高乳腺癌的诊治水平具有重要临床意义。

本发明采用芯片(Arraystar公司的Human LncRNAMicroarray v2.0)杂交的方法对人乳腺癌组织与对应的癌旁组织中lncRNA的表达差异进行筛选。按照癌组织相对于癌旁组织上调或者下调1.5倍且P值小于0.05的标准(P值计算根据随机方差模型的统计方法)，筛选出差异表达的lncRNA数目是548条(其中lncRNA上调224条，下调324条)分层聚类分析结果显示差异表达的lncRNA能将癌组织和癌旁组织进行正确的分类，说明lncRNA在乳腺癌组织中存在特征性的表达。

表1是芯片筛选的乳腺癌差异表达lncRNAs。

表1

其中，“FCAbsolute”：即倍数变化，指两组间(“上调”组的癌/癌旁数值和“下调”组的癌旁/癌数值)归一化强度的绝对比值(非对数范畴)。

“P-value”：由配对t检验计算得出；

“Relationship”：与LncRNA及其临近编码基因的关系，以及编码基因的位置

"sense overlapping"：指lncRNA的外显子在同一基因链上重叠了一个编码转录的 外显子；

"intronic"：指LncRNA在同一基因链上重叠了一个编码转录的内含子；

"natural antisense":指LncRNA由反义链转录而来并与一个编码转录本重叠；

"non-overlapping antisense"：指LncRNA由反义链转录而来并没有共同重叠的外显子；"bidirectional"：指LncRNA是头对头导向一个1000bp以内的编码转录本；

"intergenic"：指LncRNA没有重叠或附近没有双向编码转录本。

更进一步，本发明提供了其中一条长链非编码RNA-APOC1P1-3基因在在用于制备靶点标志物中的用途，尤其是该长链非编码RNA-APOC1P1-3基因在用于制备诊断和治疗乳腺癌新的靶点标志物中的用途。

所述的APOC1P1-3(NR_028414)为上述LncRNA表达谱中上调的一条LncRNA，是APOC1P1基因的第三个转录本。

本发明经试验表明，所述的APOC1P1-3能结合tubulin蛋白；本发明进行了RNAPull Down实验、考马斯亮蓝染色和蛋白质银染色及质谱分析，其中，考马斯亮蓝染色和银染色实验结果显示，成功地Pull Down蛋白质，并检测到与目的基因APOC1P1-3特异结合的蛋白质(如图1所示)；质谱分析成功鉴定出与APOC1P1-3特异结合的蛋白质为tubulin，如图2所示；并且Western Blot结果同质谱结果一致，证实了质谱结果的准确性(如图3所示)。

本发明提供了乳腺癌组织和癌旁组织中lncRNA差异表达谱；进一步提供其中一条长链非编码RNA-APOC1P1-3基因，通过实验证实了APOC1P1-3能与tubulin结合，其抑制乳腺癌细胞凋亡，促进乳腺癌细胞增殖，进而在乳腺癌的发生发展中发挥作用，本发明提供了乳腺癌的诊断和治疗新的靶点，所述的长链非编码RNA-APOC1P1-3基因可用于制备靶点标志物，尤其是该长链非编码RNA-APOC1P1-3基因可用于制备诊断和治疗乳腺癌新的靶点标志物。本发明对提高乳腺癌的诊治水平具有重要临床意义。

附图说明

图1：银染色检测Pull Down蛋白质，其中，箭头表示与APOC1P1-3特异结合的蛋白质，n＝3。

图2：质谱分析特异条带蛋白质成份为tubulin，其中，

图2A鉴定蛋白质的质谱图谱；图2B红色箭头代表人类蛋白质，与本发明中使用的MDA-MB-231细胞株的种属一致；图2C具体列出序列号gi|3745822、gi|18088719、gi|338695分别对应的质谱详细结果，包含得分和氨基酸序列等。

图3，Western Blot验证质谱结果，其中显示在乳腺癌MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中获得与BCL1结合的蛋白质为tubulin。

图4，Mascot检索软件鉴定蛋白质。

以下结合附图和实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

具体实施方式

实施例1乳腺癌组织中差异lncRNA的表达谱

采用5例离体的冰冻的新鲜人乳腺癌组织标本及配对的癌旁组织标本(来自复旦大学附属肿瘤医院乳腺外科，已获得了病人的知情同意)用于芯片分析；按下述步骤：

(1)使用TRIzol reagent提取组织标本总RNA，并用RNasey Mini Kit纯化提取的RNA；

(2)使用QuickAmp Labeling Kit,One-Color(Agilent p/n 5190-0442)合成、标记双链cDNA；

(3)标记的双链cDNA纯化后杂交于Arraystar公司的Human 8x60K LncRNA expression array information芯片；

(4)杂交漂洗之后由Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n G2565BA)扫描仪进行扫描分析；

(5)原始数据分析由Agilent Feature Extraction Software软件完成，差异基因的筛选使用配对随机方差模型的方法，差异基因的标准为癌组织中变化表达1.5倍以上及P值≤0.05；获得如表1所示的乳腺癌差异表达lncRNAs。

实施例2、RNAPull Down

(1)质粒酶切

反应成份及条件：

(2)线性DNA鉴定

利用普通琼脂糖凝胶电泳(TBE配制)检测质粒DNA是否酶切成线性，1μlDNA与5μl 6x上样缓冲液充分混匀，加入1.5％琼脂糖凝胶上样孔，60V25min电泳，紫外观察条带，天能凝胶成像系统拍照分析；

(3)线性DNA纯化

1)在酶切反应中加入等体积的溶液I，混匀(DNA样品为20μl，则加入20μl溶液I)；2)加入到DNA纯化柱中，室温放置1min；3)12000rmp 1min离心，倒弃收集管内的液态；4)DNA纯化柱内加入700μl溶液II，室温放置1min；5)12000rmp 1min离心，洗去杂质，倒弃收集管内的液体；6)再加入500μl溶液II，12000rmp 1min离心以进一步洗去杂质，倒弃收集管内的液体；7)12000rmp 1min离心，除去残留液体并让残留的乙醇充分挥发；8)将DNA纯化柱置于1.5ml离心管上，加入30μl溶液III至管内柱面上，室温放置1min；9)12000rmp 1min离心所得液体即为高纯度DNA；

(4)体外转录并标记RNA

反应步骤：

1)依次加入以下试剂

2)加入2μl DNase I后37℃孵育20min；3)加入2μl 0.5M EDTA、2.5μ l4M LiCl和75μl无水乙醇混匀，-80℃过夜沉淀RNA；4)12000rmp 30min 4℃离心；5)弃上清，加入75％乙醇漂洗RNA沉淀，12000rmp 30min 4℃离心；6)弃上清，加入适量RNase-free Water溶解RNA，冰上放置；7)1％普通琼脂糖凝胶快速电泳检测RNA的完整性(-80℃保存)；

(5)RNAPull Down

实验原理：体外转录时U碱基标记上biotin，磁珠上带有streptavidin，biotin和streptavidin能形成类似于共价的结合，因此标记的RNA就可以结合到磁珠上；细胞内本身与RNA结合的蛋白质在一定条件下可以结合到RNA-磁珠复合物上，从而被Pull Down下来；

实验步骤：1)准备细胞裂解液(用温和的IP裂解液裂解细胞，每个反应需蛋白2mg)；2)重悬磁珠，吸取50μl磁珠(每个反应的量)于新的EP管中，PBS清洗磁珠，5000rmp 3min室温离心收集磁珠，重复清洗四遍；3)向磁珠中加入100μl RNA Capture Buffer混匀再加入5μg RNA室温摇动孵育30min；4)5000rmp 3min室温离心收集磁珠，PBS清洗磁珠两遍；5)向磁珠中加入100μl1X Protein-RNA Binding Buffer混匀，5000rmp 3min室温离心收集磁珠；6)向磁珠中加入10μl 10X Protein-RNA Binding Buffer、30μl 50％glycerol、5M NaCl、细胞裂解液、最后加Nuclease-free water补齐到100μl；7)室温摇动孵育3h；8)5000rmp 3min室温离心收集磁珠，PBS清洗磁珠十遍；9)向磁珠中加入30μl5x SDS Loading Buffer，100℃煮沸30min，12000rmp 10min室温离心收集上清于新的EP管中；10)取其中一部分进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白(剩下的部分直接进行质谱分析)；

(6)考马斯亮蓝染色

原理：考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，于蛋白结合则呈现蓝色。

1)将电泳后的SDS-PAGE凝胶(8cm×10cm)取下放入容器中，加入50ml三蒸水缓慢加热至沸腾后停止后弃去水溶液；2)加入50ml染色液(按盛胶容器的大小而定，以浸没胶面为准)，缓慢加热至沸腾后保持沸腾状态30s-60s，停止 加热后继续在摇床上摇动大于1h；3)弃去染色液，加入50ml三蒸水缓慢加热至沸腾后保持沸腾状态30s-60s；4)弃去三蒸水，加入50ml脱色液在摇床上摇动直到可见清晰的蛋白条带为止(期间可更换脱色液2-3次)；5)紫外观察，凝胶图像系统拍照处理；

(7)快速银染色

原理：蛋白质的各种基团可以同银结合。注意：此步骤中所有的溶液配制所用的水均是三蒸水。

步骤：1)固定：电泳结束后，取下SDS-PAGE凝胶(8cm×10cm)放入容器中，加入100ml固定液(固定液应浸没凝胶)，在摇床上室温摇动20min，摇动速度为60rpm-70rpm(注意：固定40min以上甚至过夜可以进一步降低背景)；2)30％乙醇洗涤：弃固定液，加入100ml 30％乙醇，在摇床上室温摇动10min，摇动速度为60rpm-70rpm；3)水洗涤：弃30％乙醇，加入200ml三蒸水，在摇床上室温摇动10min，摇动速度为60rpm-70rpm；4)增敏：弃水，加入100ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2min，摇动速度为60rpm-70rpm(注意：银染增敏液(1X)配制后需在2h内使用)；5)水洗涤：弃原有溶液，加入200ml三蒸水，在摇床上室温摇动1min，摇动速度为60rpm-70rpm；6)重复上一步骤一遍；7)银染：弃水，加入100ml银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10min，摇动速度为60rpm-70rpm(银溶液(1X)配制后需在2h内使用)；8)水洗涤：弃原有溶液，加入100ml三蒸水，在摇床上室温摇动1min-1.5min，摇动速度为60rpm-70rpm(注意：此处水洗涤的时间不能超过1.5min，时间过长会影响显色效果)；9)显色：弃水，加入100ml银染显色液，在摇床上室温摇动3min-10min，摇动速度为60rpm-70rpm，直至出现比较理想的预期蛋白条带(注意：银染显色液配制后需在20min内使用)；10)终止：弃银染显色液，加入100ml银染终止液(1X)，在摇床上室温摇动10min，摇动速度为60rpm-70rpm(注意：终止时有气体产生属于正常现象，产生的气体为二氧化碳；银染终止液(1X)配制后宜当天使用)；11)水洗涤：弃银染终止液，加入100ml三蒸水，在摇床上室温摇动5min，摇动速度为60rpm-70rpm；12)凝胶图像处理系统拍照(可置于三蒸水中保存)；13)将凝胶上特异的蛋白质切割下来，质谱检测该条带所对应的蛋白质；

(8)质谱分析蛋白质成份

将上述步骤银染显色后的特异条带处的凝胶切割下来，行质谱鉴定蛋白质；凝胶使用Trypsin酶解，MALDI-TOF-TOF质谱仪分析，分析类型是MS/MS Ion Search，Mascot检索软件鉴定蛋白质，根据-10*Log对蛋白质进行打分，得分在83分以为有意义的(P<0.05)(如图4所示)；

(9)Western Blot验证质谱结果

质谱分析显示与BCL1特异结合的蛋白质为tubulin。为了验证质谱结果的准确性，使用相同的方法，在MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中获得与BCL1结合的蛋白质，普通SDS-PAGE凝胶电泳，特异的tubulin抗体检测；结果显示Western Blot结果同质谱结果一致，即与BCL1结合的蛋白质为tubulin。