本发明涉及一种氘标记玉米赤霉烯酮及其衍生物的合成方法，以及所述氘标记玉米赤霉烯酮及其衍生物作为内标物在玉米赤霉烯酮及其衍生物的质谱检测方法中的应用，属于化工技术领域。
背景技术：
玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)又称f2毒素，是由玉米赤霉菌产生的一种具有类雌激素作用的真菌次生代谢产物，其化学名为6-(10-羟基-6氧基-十一-碳烯基)β-雷锁酸内酯，主要存在于玉米和玉米制品中，小麦、高粱以及大米中也有一定程度的分布。
玉米赤霉烯酮，及其衍生物(例如玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮等)，具有很强的雌性激素类物质的生物活性，对哺乳动物具有一定的生殖毒性和致畸作用，例如摄入被玉米赤霉烯酮及其衍生物污染的饲料可导致家禽，特别是猪牛羊等动物产生雌激素过多症、繁殖机能异常甚至死亡，给畜牧业带来了较大的损失。
玉米赤霉烯酮及其衍生物的食源性危害受到越来越多的关注。2002年，中国农业部第193号公告明确规定玉米赤霉醇禁用于所有食品动物，所有可食动物不得检出；2010年卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第四批)》中明确将玉米赤霉醇列入非食用物质。
为防止玉米赤霉烯酮及其衍生物进入食物链，政府监控部门需要一种能够快速、准确并很敏感的技术来检测它们。
现今检测玉米赤霉烯酮及其衍生物常用的方法有：酶联免疫吸附法(elisa)、薄层色谱法、免疫亲和柱-hplc法、质谱技术等。然而，由于玉米赤霉烯酮及其衍生物等兽药残留分析过程中存在着待测物质浓度低、样品基质复杂、干扰物质多、代谢产物多样或不明确等问题，其检测阳性结果均须通过明确的验证方法来进行定性和定量分析，而这些检查方法中，只有质谱检测能够同时提供定性和定量信息。因此，发达国家对于动物源性食品中的兽药残留检测均要求采用同位素稀释质谱法测试，能够有效地校正方法中出现的误差，显著提高检测方法的准确性。
稳定同位素稀释质谱法idms(isotopedilutionmassspectrometry)是采用与被测物质具有相同分子结构的稳定同位素标记的化合物作为内标物质，用液相色谱-质谱联用仪(lc/ms)进行检测，通过质谱仪测量相应质量数的离子的比值并与标准的比值比较达到准确定量的目的。该方法被公认为是一种测量微量及痕量有机物的基准方法。
因此，采用何种同位素标记的玉米赤霉烯酮及其衍生物作为质谱检测的内标物质，以及如何合成该同位素标记的玉米赤霉烯酮及其衍生物，对我国相关食品安全领域的监管检测工作具有重要意义。
技术实现要素：
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明提供了一种氘标记玉米赤霉烯酮及其衍生物的合成方法，所述氘标记玉米赤霉烯酮及其衍生物选自式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮、式(2)的氘标记玉米赤霉酮、式(3)的氘标记玉米赤霉烯醇和式(4)的氘标记玉米赤霉醇的其中之一，
所述合成方法包括采用下述式(b)化合物合成式(a)的氘标记化合物的过程，
在式(a)和式(b)结构式中，c1和c2两个碳原子之间的虚线表示两个碳原子之间的化学键是单键或者是双键；
所述采用式(b)化合物合成式(a)化合物的过程包括以下步骤：1)将碱金属、碱金属的氘化物、碱土金属或碱土金属的氘化物中的其中一种或几种溶解于氘标记的烷基醇中制备获得反应剂；所述氘标记的烷基醇具有r-od的结构式，其中r为c1-c5的全氘取代、部分氘取代或未被氘取代的烷基；2)将下式(b)化合物置于步骤(1)获得的反应剂中进行氢-氘置换反应获得所述具有式(a)的氘标记化合物；所述步骤1)和步骤2)在惰性气体氛围保护下进行。
优选的，所述碱金属为钠或钾。
优选的，所述碱土金属为镁或钙。
优选的，所述氘标记的烷基醇的结构式中，r为全氘取代的甲基或乙基。
优选的，所述步骤2)在温度为20℃-80℃的条件下进行。
优选的，在所述步骤2)中，式(b)化合物与所述反应剂中的碱金属和/碱土金属元素的摩尔比值为1:2～1:10。
优选的，所述合成方法还包括在步骤2)之后的式(a)的氘标记化合物的纯化步骤，所述纯化步骤包括首先将步骤2)所得溶液的ph值调节至1-5之后旋干，然后加水并将所得溶液调节至碱性，再采用有机溶剂萃取的过程。
优选的，所述有机溶剂为二氯甲烷。
优选的，所述惰性气体为氮气。
优选的，所述式(b)化合物中的c1和c2两个碳原子之间的化学键是双键，经过所述步骤1)和步骤2)生成式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮；
采用硼氢化钠和甲醇作为还原试剂还原式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮获得所述式(3)的氘标记玉米赤霉烯醇，反应温度为0℃-30℃；或者，
采用三异丙氧基铝和异丙醇作为还原试剂还原式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮获得所述式(3)的氘标记玉米赤霉烯醇，反应温度为55℃-95℃；
在有机溶剂环境下，采用雷尼镍或pd/c作为催化剂并通入氢气来还原式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮获得所述式(4)的氘标记玉米赤霉醇；或者，
在有机溶剂环境下，采用氧化铂并通入氢气来还原式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮获得所述式(2)的氘标记玉米赤霉酮，反应温度为30℃-60℃。
本发明的氘标记玉米赤霉烯酮及其衍生物的合成方法，发明人意外的发现，采用特定方法配制的反应剂进行氢氘置换可以合成四氘取代的式(1)～(4)的氘标记化合物，合成方法简单，反应条件温和，转化效率高，并且产物的纯度较高，同位素丰度高。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。
在本发明的一个具体实施方案中，一种氘标记玉米赤霉烯酮及其衍生物的合成方法，所述氘标记玉米赤霉烯酮及其衍生物选自式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮、式(2)的氘标记玉米赤霉酮、式(3)的氘标记玉米赤霉烯醇和式(4)的氘标记玉米赤霉醇的其中之一，
所述合成方法包括采用下述式(b)化合物合成式(a)的氘标记化合物的过程，
在式(a)和式(b)结构式中，c1和c2两个碳原子之间的虚线表示两个碳原子之间的化学键是单键或者是双键；
具体来说，当c1和c2两个碳原子之间是双键时，式(a)化合物即为式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮；当c1和c2两个碳原子之间是单键时，式(a)化合物即为式(2)的氘标记玉米赤霉酮。
采用式(b)化合物合成式(a)化合物的过程包括以下步骤：
1)将碱金属、碱金属的氘化物、碱土金属或碱土金属的氘化物中的其中一种或几种溶解于氘标记的烷基醇中制备获得反应剂；
所述氘标记的烷基醇具有r-od的结构式，其中r为c1-c5的全氘取代、部分氘取代或未被氘取代的烷基；
2)将下式(b)化合物置于步骤(1)获得的反应剂中进行氢-氘置换反应获得所述具有式(a)的氘标记化合物；
所述步骤1)和步骤2)在惰性气体氛围保护下进行。
在本发明的一个具体实施方案中，碱金属可以为钠(na)、钾(k)、锂(li)、铷(rb)或铯(cs)，优选na。
在本发明的一个具体实施方案中，碱金属的氘化物可以为nad、kd或lid等，优选nad。
在本发明的一个具体实施方案中，碱土金属可以为镁(mg)、铍(be)、钙(ca)、锶(sr)或钡(ba)，优选mg。
在本发明的一个具体实施方案中，碱土金属的氘化物可以为mgd2、bed2、cad2等，优选mgd2。
在本发明的一个具体实施方案中，氘标记的烷基醇所具有的r-od的结构式中，r为c1-c5的烷基，优选，甲基或乙基。更优选，全氘取代的甲基或乙基。
在本发明的一个具体实施方案中，步骤2)的氢-氘置换反应在温度为20℃-80℃的条件下进行，可以为40℃、50℃、60℃、70℃等，优选为50℃。
在本发明的一个具体实施方案中，在所述步骤2)中，式(b)化合物与反应剂中的碱金属和/碱土金属元素的摩尔比值为1:2～1:10。该摩尔比可以为1:3，1:4，1:5，优选1:3左右。
在本发明的一个具体实施方案中，惰性气体氛围为氮气氛围。
在本发明的一个具体实施方案中，所述合成方法还包括在步骤2)之后的式(a)的氘标记化合物的纯化步骤，所述纯化步骤包括首先将步骤2)所得溶液的ph值调节至1-5之后旋干，然后加水并将所得溶液调节至碱性，再采用有机溶剂萃取的过程。在本发明的一个具体实施例中，采用盐酸的乙醇溶液将步骤2)所得溶液的ph值调节至3左右，旋干乙醇溶剂，再加入水后用氨水调节溶液至碱性，再采用二氯甲烷进行多次萃取，合并萃取所得有机相，经饱和食盐水洗涤之后，用无水硫酸钠干燥，过滤后旋干二氯甲烷溶剂，重结晶之后获得纯化后的式(a)的氘标记化合物。
在本发明的一个具体实施方案中，采用硼氢化钠和甲醇作为还原试剂还原式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮获得所述式(3)的氘标记玉米赤霉烯醇，反应温度为0℃-30℃。优选的，在naoh存在的环境下进行还原反应。优选的，反应温度为0℃-10℃。
在本发明的一个具体实施方案中，采用三异丙氧基铝和异丙醇作为还原试剂还原式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮获得所述式(3)的氘标记玉米赤霉烯醇，反应温度为55℃-95℃。优选的，反应温度约为75℃。
在本发明的一个具体实施方案中，采用雷尼镍或pd/c作为催化剂并通入氢气来还原式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮获得所述式(4)的氘标记玉米赤霉醇。优选的，采用雷尼镍作为催化剂，反应温度约为70℃。优选的，采用pd/c作为催化剂，反应温度约为20℃。
在本发明的一个具体实施方案中，采用氧化铂并通入氢气来还原式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮获得所述式(2)的氘标记玉米赤霉酮，反应温度为30℃-60℃。优选的，反应温度约为0℃。
实施例1
式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮的合成方法
步骤1)：在氮气氛围保护的圆底烧瓶中，加入cd3od(100ml)、钠(1.6g,70mmol)，搅拌至钠完全溶解后获得反应剂；步骤2)：在反应剂中加入玉米赤霉烯酮(7.3g,23mmol)，50℃反应3个小时。
反应完成后的纯化过程：将步骤2)所得产物冷却后加入盐酸乙醇溶液调节ph值至3，旋干溶剂。加入50ml水后用氨水调节至碱性，二氯甲烷萃取三次。合并的有机相经饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。过滤后旋干溶剂，重结晶得式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮5.6g，收率75％，纯度99.8％(hplc)，同位素丰度99.5％(atom％，hrms)。
1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.01(1h,d,j＝15.5hz),6.44(1h,s),6.40(1h,s),5.88(1h,m),5.01(1h,m),2.31(2h,m),2.10(2h,m),1.81(2h,m),1.67(2h,m),1.36(3h,d)。
实施例2
式(2)的氘标记玉米赤霉酮的合成方法
反应条件和纯化过程同实施例1，具体不再赘述。
实施例3
式(2)的氘标记玉米赤霉酮的合成方法
采用实施例1制得的式(1)化合物来制备式(2)化合物；
在圆底烧瓶内加入氧化铂(500mg)、乙醇(20ml)，液氮冷冻脱气，0℃下加入式(1)的氘标记玉米赤霉烯酮(515mg,1.6mmol)的乙醇溶液(10ml)，通氢气(0.1mpa)反应3小时。
过滤后旋干溶剂，乙酸乙酯溶解后硅胶柱纯化，获得式(2)的氘标记玉米赤霉酮192mg，收率37％，纯度99.7％(hplc)，同位素丰度99.2％(atom％,hrms)。
1hnmr(300mhz,acetone-d6)δ6.70(1h,s),6.12(1h,s),5.17(1h,m),3.58(2h,d),2.42(2h,m),2.10(2h,m),1.86(2h,m),1.66(2h,m),1.52(2h,m),1.34(3h,d)。
实施例4
式(3)的氘标记玉米赤霉烯醇的合成方法
采用实施例1制得的式(1)化合物来制备式(3)化合物；
在100ml烧瓶中加入氢氧化钠(60mg,1.5mmol)和甲醇10ml，冰水浴冷却下，搅拌加入硼氢化钠(130mg,3.3mmol)和氘标记玉米赤霉烯酮(515mg,1.6mmol)的甲醇溶液(5ml)。缓慢恢复至室温，反应6h后加入硼氢化钠(210mg,5.5mmol)，反应至原料消失。
蒸去部分甲醇后加入25ml水淬灭反应，乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相水洗后用无水硫酸钠干燥。过滤后除去溶剂，得氘标记玉米赤霉烯醇451mg，收率87％，纯度99.1％(hplc)，同位素丰度98.9％(atom％,hrms)。
1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.17(1h,d,j＝15.5hz),6.56(1h,s),6.21(1h,s),5.89(1h,m),5.08(1h,m),3.85(2h,m),1.95(1h,m),1.85(2h,m),1.73(2h,m),1.51(2h,m),1.34(3h,d)。
在实施例4的一个替代方案中，可以采用三异丙氧基铝和异丙醇代替硼氢化钠和甲醇作为还原试剂，反应温度由20℃变为75℃，其他条件同实施例4。
实施例5
式(4)的氘标记玉米赤霉醇的合成方法
采用实施例1制得的式(1)化合物来制备式(4)化合物；
将氘标记玉米赤霉烯酮(5.8g,18mmol)、无水乙醇174ml、催化剂raneyni(1g)投入不锈钢高压反应釜内，通入h2(0.4mpa)。70℃下搅拌6h后，反应液过滤除去催化剂，蒸去乙醇后减压蒸馏、脱色、重结晶得式(4)的氘标记玉米赤霉醇3.6g，收率62％，纯度99.5％(hplc)，同位素丰度99.3％(atom％,hrms)。
1hnmr(300mhz,acetone-d6)δ6.28(1h,s),6.22(1h,s),5.17(1h,m),3.76(1h,t),3.58(2h,d),2.42(2h,m),2.10(2h,m),1.86(2h,m),1.66(2h,m),1.52(2h,m),1.34(3h,d)。
在实施例5的一个替代方案中，采用pd/c代替raney-ni作为氢化的催化剂，反应温度由70℃变为20℃，氢气压力由0.4mpa变为0.1mpa，其他条件同实施例5。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。