新颖黏合细胞壁之胜肽序列的制作方法

本发明涉及一种胜肽序列，特别涉及一种新颖黏合细胞壁之胜肽序列。

背景技术：

畜牧养殖业的发展十分迅速，尤其是集约化饲养规模日益扩大。目前阻碍畜牧养殖业发展的主要问题是疾病，尤其是传染病。疫苗接种是预防传染病最基本、最有效的方法，但是由于多种原因，目前许多疫苗的免疫效果还不十分理想，不能对动物提供完全保护。因此人们进行了大量的研究工作，试图通过不同途径来提高疫苗的效果，这些途径包括提高疫苗质量(如增加抗原含量、增强免疫原性、使用高效佐剂、优化制苗工艺等)、改进免疫方法(如采用粘膜免疫、胚胎免疫、超前免疫等)及增强动物机体自身的免疫应答能力(如使用免疫增强剂、减少有毒物质对免疫系统的损害、控制免疫抑制性病原微生物的侵染、提供良好的饲养管理条件等)。而研究、开发新型高效佐剂是提高免疫效果的主要手段之一。

而且，透过粘膜免疫，系针对利用诱导粘膜表面的特异性病原体的igg和分泌性iga的其为一种方法，被认为是接种疫苗的有效途径。但因为由细菌载体表达的免疫原以颗粒形式呈递到免疫系统的抗原呈递细胞，因此其引起耐受性的可能性比可溶性抗原低。另外，共同粘膜免疫系统的存在允许在一特定粘膜表面免疫，从而诱导抗原特异性iga的分泌，并在远程粘膜位点诱导其它特异性免疫应答。这种方法的缺点在于菌株本身有可能引起发炎反应和细菌性传染疾病，可能引起动物体发烧和菌血症。另一种方法通过选择如乳杆菌(lactobacillusssp)和乳球菌(lactococcusssp)的重组共生菌作为疫苗载体，避免了使用其本身会变为致病菌的减毒菌株。

然而，使用这种重组生物的缺点在于它们可建群于粘膜表面，从而导致长期暴露于这些重组微生物表达和释放的目标抗原。这种长期的暴露可以引起免疫耐受性。此外，单单这种生物体被遗传修饰并含有重组核酸这样的事实，在整体上正面临公众的极大反对，这是由于对含有重组dna或rna的产品的普遍接受性水平低。同样存在对使用致病性菌株(即使是减毒的)的反对，或者反对使用来自致病菌株的蛋白质或蛋白质的部分。以前被称之为“外壳”的肽聚糖颗粒仍然包含具有免疫调节性质的细菌成分，如肽聚糖。

因此，本发明的目的是克服这些限制。为此目的，开发了新颖黏合细胞壁之胜肽序列，其既可以利用非共价键结合免疫原性载体(如gem颗粒)的功能性。所述新颖黏合细胞壁之胜肽序列可以使任何目标抗原不经过预先的修饰而固定在gem颗粒的表面。所述抗原可以是(多)肽、糖类、脂类、dna、rna或任何其它生物有机化合物，甚至本身可以具有颗粒性质，例如病毒颗粒。

从而，各界莫不期待开发出一种能够解决增加抗体有效的方式及生产成本、防止疾病不符需要等之传统技术问题点的新颖黏合细胞壁之胜肽序列；以及殷切期盼开发出一种能够解决疫苗稳定性低、抗紫外线力欠缺、防疫效能持续力弱等之传统技术的问题点的新颖黏合细胞壁之胜肽序列。

技术实现要素：

具体而言，根据本发明之一观点可以提供一种新颖黏合细胞壁之胜肽序列，其对细菌之细胞壁具有结合专一性，包含seqid：no.1的胜肽序列。

又，在某些具体实施例，在本发明之适用于新颖黏合细胞壁之胜肽序列，其中所述胜肽序列为人工合成。

另，在某些具体实施例，在本发明之适用于新颖黏合细胞壁之胜肽序列，其中该胜肽序列之编码基因为seqidno.2。

其中，在某些具体实施例，在本发明之适用于新颖黏合细胞壁之胜肽序列，其中所述胜肽的编码基因的序列之大小为294碱基。

另一观点，在某些具体实施例，在本发明之适用于新颖黏合细胞壁之胜肽序列，其中所述胜肽序列能够非共价结合于细菌之细胞壁，且具有结合专一性。

又一观点，在某些具体实施例，在本发明之适用于新颖黏合细胞壁之胜肽序列，其中所述胜肽序列之氨基酸序列，而所述胺基酸序列中一或多个氨基酸，可进一步被其他的氨基酸所置换。

其中，在某些具体实施例，在本发明之适用于新颖黏合细胞壁之胜肽序列，其中所述胜肽序列系结合自嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)、卷曲乳杆菌(lactobacilluscrispatus)、保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus)、德氏乳杆菌(lactobacillusdelbrueckii)、发酵乳杆菌(lactobacillusfermentium)、格氏乳杆菌(lactobacillusgasseri)、瑞士乳杆菌(lactobacillushelveticus)、约氏乳杆菌(lactobacillusjohnsonii)、副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)、唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)，以及乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubspecieslactis)中的至少其中一种。

又，根据某些具体实施例，进一步可以为一种疫苗之佐剂组成物，其包含革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌结合于本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列。

另，根据某些具体实施例，一种致免疫性蛋白质疫苗，其所述蛋白质疫苗系至少包括一个或复数个seqid：no.1的胜肽序列。

又，根据某些具体实施例，一种疫苗组成物，其所述疫苗组成物系至少包括一个或复数个seqid：no.1的胜肽序列。

附图说明

图1是显示在本发明中所使用的gpem及gnem之光学显微镜下照片图。

图2是显示在本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列和gpem及gnem黏合作用后，利用高速西方点墨法，分析蛋白质表达的结果图。

图3是显示在本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列和gpem及gnem黏合作用后，利用高速西方点墨法，分析蛋白质表达的结果图。

具体实施方式

以下，针对本发明的实施态样列举不同的具体实施例而更加详尽地叙述与说明，以便使本发明的精神与内容更为完备而易于了解；然而，本项技艺中具有通常知识者应当明了本发明当然不受限于此等实例而已，亦可利用其他相同或均等的功能与步骤顺序来达成本发明。

此外，借由下述具体实施例，可进一步证明本发明可实际应用之范围，但不意欲以任何形式限制本发明之范围。

术语“抗原结合”意指结合目标抗原的能力。所述能力由至少一种双功能多肽赋予。

术语“双功能”表示所述多肽具有至少两种不同的功能性：肽聚糖结合功能性和抗原结合功能性。所述功能性可以是多价的，例如双功能多肽可以包含多个抗原结合位点。

本文术语之〝动物〞意指所有非人类动物，包括哺乳动物。

本文术语之〝禽类〞意指小鸡、鸡、火鸡、鸭、母鸡、雌鸡、阉鸡、土鸡、公鸡、山鸡及禽类属之成员。

较佳者，本发明方法系施用于非人类之哺乳动物；最佳者为动物。

术语“免疫原性载体”是指在施用到对象时具有提高或修饰附着到其上的抗原的免疫刺激性的能力的部分，因此免疫原性载体具有佐剂性质。

在一个优选实施方式中，所述免疫原性载体复合物为由革兰氏阳性菌制得的无活力球状肽聚糖颗粒(gem颗粒，或者“外壳”)。

制备gem颗粒的方法以前已经描述，例如在专利申请wo02/101026和wo2004/102199中。所述方法保留了所述细菌的天然球状结构的大部分。简而言之，所述方法包括用能够从细胞壁物质除去细胞壁成分(如蛋白质、脂胞壁酸或糖类)的溶液处理革兰氏阳性菌。

本文术语之〝有效量〞意指于投用后可充分引起免疫反应的抗原量。免疫反应包含(而未限制)先天诱发的、细胞的及/或体液免疫反应。

在本文中，对于用以界定本发明范围的数值与参数，本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差，因而大多是以约略的数量值来表示，然而于具体实施例中则尽可能精确呈现的相关数值。在本文中，「约」通常视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定，一般系指代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，例如，所述实际数值为在一特定数值或范围的±10％、±5％、±1％、或±0.5％以内。

《制备新颖黏合细胞壁之胜肽序列》

首先，利用自动化固相胜肽合成仪(abi433apeptidesynthesizer,appliedbiosystemsinc.,lifetechnologiescorp.,fostercity,ca,usa)，并依据设备商所提供的标准流程(依据nα-9-芴甲氧基羰基化学)来合成seqid：no.1的胜肽序列，揭示于下列seqid：no.1。

本发明之seqid：no.1系为：

mrgshhhhhhgmasmtggqqmgrdlyddddkdptlmketaaakferqhmdspdlsgsgsgsgsawshpqfekgadisgsgsgsgsgellevlfqgprs。

本发明之胜肽序列的编码基因seqidno.2系为：

atgcggggttctcatcatcatcatcatcatggtatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgggatctgtacgacgatgacgataaggatccaacccttatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgagcggctctggatcaggatctggcagcgcttggagccacccgcagttcgaaaaaggcgccgatatcagcggctcaggatctggatcaggatctggcgaattgcttgaagtcctctttcagggacccagatct。

本发明内容所指的氨基酸的分类及缩写：脂肪性氨基酸类(aliphatic)包括：丙氨酸(alanine，a)、异亮氨酸(isoleucine，i)、亮氨酸(leucine，l)、缬氨酸(valine，v)、脯氨酸(proline，p)。芳香性氨基酸类(aromatic)包括：苯丙氨(phenylalanine，f)、色氨酸(tryptophan，w)、酪氨酸(tyrosine，y)。酸性氨基酸类(acidic)包括：天冬氨酸(asparticacid，d)、谷氨酸(glutamicacid，e)。碱性氨基酸类(basic)包括：精氨酸(arginine，r)、组氨酸(histidine，h)、赖氨酸(lysine，k)。羟基氨基酸类(hydroxylic)包括：丝氨酸(serine，s)，、苏氨酸(threonine，t)。含硫氨基酸类(sulfurcontaining)包括：半胱氨酸(cysteine，c)、甲硫氨酸(methionine，m)。酰胺氨基酸类(amidic)包括：天冬酰胺(asparagine，n)、谷氨酰胺(glutamine，q)。

《实施例1》

《制备革兰氏阳性菌gram-positiveenhancermatrix,gpem》

用于制备gpem的乳酸乳球菌(lactococcuslactis，cicc20209)通常用氯化氢(hcl，ph1.0)按照如下步骤进行化学预处理：通过离心收集稳定期培养物细胞，并用0.5体积的磷酸缓冲盐溶液(pbs：58mmna2hpo4，17mmnah2po4，68mmnacl，ph7.2)洗涤一次。在1/5体积的hcl，ph1.0溶液中重悬细胞并煮沸30分钟。然后，用pbs洗涤依此方式形成的gpem颗粒三次，在pbs中重悬，直到用burker-turk血球计测定为平均2.5×10¹⁰gpem颗粒/ml，其为图1显示。所得的gpem颗粒可立即用于含有本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列进行黏合作用，或者以1.0ml等分试样在-80℃保存直至使用。

《制备革兰氏阴性菌gram-negativeenhancermatrix,gnem》

用于制备gnem的大肠杆菌(escherichiacoli，atcc25922)通常用氯化氢(hcl，ph1.0)按照如下步骤进行化学预处理：通过离心收集稳定期培养物细胞，并用0.5体积的磷酸缓冲盐溶液(pbs：58mmna2hpo4，17mmnah2po4，68mmnacl，ph7.2)洗涤一次。在1/5体积的hcl，ph1.0溶液中重悬细胞并煮沸30分钟。然后，用pbs洗涤依此方式形成的gnem颗粒三次，在pbs中重悬，直到用burker-turk血球计测定为平均2.5×10¹⁰gnem颗粒/ml。所得的gnem颗粒可立即用于含有本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列进行黏合作用，或者以1.0ml等分试样在-80℃保存直至使用。

再来进行黏合作用中，取上述各所得的2.5×10¹⁰为1单位之gpem颗粒及gnem颗粒，和2ml含有本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列的培养基一起混合，然后再轴向旋转器(over-endrotator)中于室温培育30分钟。结合后，通过离心收集gpem颗粒及gnem颗粒，再用pbs洗涤两次。

如上所述所收集到的gpem颗粒及gnem颗粒，藉由高速西方点墨法(west-blot)来进行蛋白质表达分析，每个样本放入1毫克，进行30秒的曝光监测后，分析蛋白质表达。

图2系显示在本发明的一具体实施例中之新颖黏合细胞壁之胜肽序列之gpem和gnem黏合作用后，利用高速西方点墨法，分析蛋白质表达。

在所述图2中，s1系表示磷酸缓冲盐溶液和gnem进行黏合反应之蛋白质表达；s2系表示含有本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列在磷酸缓冲盐溶液中和gnem进行黏合反应之蛋白质表达；s3系表示磷酸缓冲盐溶液和gpem进行黏合反应之蛋白质表达；s4系表示含有本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列在磷酸缓冲盐溶液中和gpem进行黏合反应之蛋白质表达。

《实施例2》

《制备革兰氏阳性菌gram-positiveenhancermatrix,gpem》

用于制备五种gpem颗粒其为乳酸乳球菌cicc20209、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis，cicc10012)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis，cicc20062)、链霉菌a(streptomyceslipamanii，cicc10513)、链霉菌b(streptomycesrimosus，cicc11004)，通常用氯化氢(hcl，ph1.0)按照如下步骤进行化学预处理：通过离心收集稳定期培养物细胞，并用0.5体积的磷酸缓冲盐溶液(pbs：58mmna2hpo4，17mmnah2po4，68mmnacl，ph7.2)洗涤一次。在1/5体积的hcl，ph1.0溶液中重悬细胞并煮沸30分钟。然后，用pbs洗涤依此方式形成的gpem颗粒三次，在pbs中重悬，直到用burker-turk血球计测定为平均2.5×10¹⁰gpem颗粒/ml。所得的gpem颗粒可立即用于含有本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列进行黏合作用，或者以1.0ml等分试样在-80℃保存直至使用。

《制备革兰氏阴性菌gram-negativeenhancermatrix,gnem》

用于制备gnem的大肠杆菌(escherichiacoli，atcc25922)通常用氯化氢(hcl，ph1.0)按照如下步骤进行化学预处理：通过离心收集稳定期培养物细胞，并用0.5体积的磷酸缓冲盐溶液(pbs：58mmna2hpo4，17mmnah2po4，68mmnacl，ph7.2)洗涤一次。在1/5体积的hcl，ph1.0溶液中重悬细胞并煮沸30分钟。然后，用pbs洗涤依此方式形成的gnem颗粒三次，在pbs中重悬，直到用burker-turk血球计测定为平均2.5×10¹⁰gnem颗粒/ml。所得的gnem颗粒可立即用于含有本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列进行黏合作用，或者以1.0ml等分试样在-80℃保存直至使用。

再来进行黏合作用中，取上述各所得的2.5×10¹⁰为1单位之gpem颗粒及gnem颗粒，和2ml含有本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列的培养基一起混合，然后再轴向旋转器(over-endrotator)中于室温培育30分钟。结合后，通过离心收集gpem颗粒及gnem颗粒，再用pbs洗涤两次。

如上所述所收集到的gpem颗粒及gnem颗粒，藉由高速西方点墨法(west-blot)来进行蛋白质表达分析，每个样本放入1毫克，进行30秒的曝光监测后，分析蛋白质表达。

图3系显示在本发明的一具体实施例中之新颖黏合细胞壁之胜肽序列之gpem和gnem黏合作用后，利用高速西方点墨法，分析蛋白质表达。

在所述图3中，s5系表示含有本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列在磷酸缓冲盐溶液中和大肠杆菌(escherichiacoli，atcc25922)为gnem的进行黏合反应之蛋白质表达；s6系表示含有本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列在磷酸缓冲盐溶液中和枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis，cicc10012)为gpem进行黏合反应之蛋白质表达；s7系表示含有本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列在磷酸缓冲盐溶液中和粪肠球菌(enterococcusfaecalis，cicc20062)为gpem进行黏合反应之蛋白质表达；s8系表示含有本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列在磷酸缓冲盐溶液中和乳酸乳球菌(lactococcuslactis，cicc20209)为gpem进行黏合反应之蛋白质表达；s9系表示含有本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列在磷酸缓冲盐溶液中和链霉菌a(streptomyceslipamanii，cicc10513)为gpem进行黏合反应之蛋白质表达；s10系表示含有本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列在磷酸缓冲盐溶液中和链霉菌b(streptomycesrimosus，cicc11004)为gpem进行黏合反应之蛋白质表达。

本发明中所用的革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌之相关菌种皆采用市场上购得的菌种，本发明的技术方案不依赖菌种的特定菌株，经多次试验，从各生物制品企业购得菌种均能达到预定效果。

从而，可以确认本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列，因为新颖黏合细胞壁之胜肽序列与革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的结合效果强，由此可以有效应用于开发免疫刺激性佐剂。本发明之新颖黏合细胞壁之胜肽序列能够明显地黏着于具能引起免疫性反应的细菌细胞壁，进而可以开发为具有免疫促进剂效果之佐剂及其相关应用。

综上所述，本发明的内容已经以如上的实施例举例说明了，然而本发明并非仅限定于此等实施方式而已。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可再进行各种的更动与修饰；例如，将前述实施例中所例示的各技术内容加以组合或变更而成为新的实施方式，此等实施方式也当然视为本发明所属内容。因此，本案所欲保护的范围也包括后述的申请专利范围及其所界定的范围。