技术领域本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种提高玉米抗旱性的方法。
背景技术：
玉米是全球种植范围最广、产量最大的谷类作物，居三大粮食作物之首。我国是玉米生产和消费大国，播种面积、总产量、消费量仅次于美国，均居世界第二位。但我国的玉米生产面临非常严峻的干旱问题，频繁发生的旱灾使玉米产量蒙受了巨大损失，根据农业部的统计，我国玉米产量发生波动的最主要原因是干旱，例如2000年因严重干旱导致全国粮食减产462亿公斤，其中玉米减产221亿公斤，占减产量的48％。因此培育抗旱玉米新品种对我国粮食生产具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种提高玉米抗旱性的方法，该方法通过将CKX3基因转入玉米基因组中，从而大大提高了玉米的抗旱性。本发明的发明人经过研究发现，通过将CKX3基因转入玉米基因组中，可以诱导玉米植株根中特异表达CKX3基因，从而促进玉米根系的生长发育，有利于玉米植株获得土壤深层的水分，从而提高玉米的抗旱性，同时还不会影响玉米在正常水分条件下的生长发育。本发明提供了一种提高玉米抗旱性的方法，所述方法包括将CKX3基因转入玉米基因组中的步骤；所述CKX3基因具有序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。优选地，该方法包括构建CKX3基因的植物表达载体，并用所述CKX3基因的植物表达载体转化玉米的步骤。优选地，所述CKX3基因的植物表达载体的出发载体为PGreen0229质粒载体，所述CKX3基因的植物表达载体带有启动子EXP18-D基因、终止子Nos基因和CKX3基因。优选地，所述CKX3基因的植物表达载体的标记基因为抗除草剂的35SBar基因。优选地，所述35SBar基因具有序列表中SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；所述Nos基因具有序列表中SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；所述EXP18-D基因具有序列表中SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。优选地，所述构建CKX3基因的植物表达载体包括以下步骤：先将所述35SBar基因连接到PGreen0229质粒载体，得到35SBar-PGreen0229质粒载体；再将所述Nos基因连接到所述35SBar-PGreen0229质粒载体，得到Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体；再将所述EXP18-D基因连接到所述Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体，得到EXP18-D-Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体；最后将所述CKX3基因连接到所述EXP18-D-Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体，得到所述CKX3基因的植物表达载体。优选地，通过花粉管通道法用所述CKX3基因的植物表达载体转化玉米。优选地，所述通过花粉管通道法用所述CKX3基因的植物表达载体转化玉米包括以下步骤：先对玉米植株进行套袋授粉处理；再对所述玉米植株的花穗进行修剪处理；在所述修剪处理形成的切口处用所述CKX3基因的植物表达载体转化玉米。优选地，使用线性DNA在所述修剪处理形成的切口处用所述CKX3基因的植物表达载体转化玉米；其中，所述线性DNA通过以所述CKX3基因的植物表达载体为模板进行PCR扩增反应获得，所述PCR扩增反应使用的引物对具有序列表中SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。优选地，所述PCR扩增反应的程序为：96℃预变性4min；98℃变性10s，56℃退火15s，72℃延伸7min，共30个循环；72℃延伸10min。本发明提供的提高玉米抗旱性的方法具有如下有益效果：1、本发明采用来自单子叶植物水稻的根特异启动子EXP18-D来驱动拟南芥CKX3基因表达在玉米自交系中，促进了玉米根系的生长发育，有利于玉米植株获得土壤深层的水分，从而提高了转基因玉米的抗旱性。2、本发明的方法能够促进玉米根系的生长以增加各种营养离子的吸收，对转基因玉米在正常有水分条件下的生长发育没有负面影响，就是说在干旱条件下能够提高转基因玉米产量，而水分充足条件下转基因玉米产量不减产，甚至还能增产。本发明的其他特征和优点将在如下的具体实施方式部分详细描述。附图说明图1为实施例1中构建得到的植物表达载体的图谱。图2为实施例1中构建得到的植物表达载体的酶切产物电泳图。图3为实施例3中玉米基因组PCR扩增反应产物电泳图。图4为实施例3中转基因植株的Southern杂交结果图。图5为实施例3中比较对照植株和转基因株系在旱棚中的生长情况的照片。图6为实施例3中比较对照植株和转基因株系的根长的照片。图7为实施例3中比较对照植株和转基因株系的根长的柱状图。图8为实施例3中比较对照植株和转基因株系的株高的折线图。图9为实施例3中比较对照植株和转基因株系的叶面积的折线图。图10为实施例3中比较对照植株和转基因株系结实情况的照片。图11也为实施例3中比较对照植株和转基因株系结实情况的照片。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的实施方式作进一步地详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。实施例1：本实施例用来说明CKX3基因的获取，以及CKX3基因的植物表达载体的构建；该CKX3基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：1所示。CKX3基因的植物表达载体的构建方法包括以下步骤：(1)CKX3基因的获得：CKX3基因根据拟南芥基因At5g56970cDNA序列由上海生工生物有限公司合成，其核苷酸序列在序列表SEQIDNo：1中示出；SEQIDNo：1的序列的两端带有speI和NotI酶切位点，连接在puc57质粒上，以puc57-CKX3质粒的形式购买得到；该CKX3基因也可以在拟南芥植物的基因组中通过RT-PCR方法克隆得到。(2)植物表达载体(CKX3-EXP18-D-Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体)的构建：方法一：①将35SBar基因连接到PGreen0229质粒载体，得到35SBar-PGreen0229质粒载体：先将puc57-35SBar质粒用SacI内切酶进行酶切反应，回收得到带有酶切位点的35SBar基因；再将PGreen0229质粒载体用SacI内切酶进行酶切反应，回收得到大小约为4451bp的片段；之后将该带有酶切位点的35SBar基因和大小约为4451bp的片段进行连接反应，得到35SBar-PGreen0229质粒载体；上述35SBar基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：2所示；该35SBar基因由生工生物有限公司合成并连接在puc57质粒上，以puc57-35SBar质粒的形式购买得到。②将Nos基因连接到上述35SBar-PGreen0229质粒载体，得到Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体：先将puc57-Nos质粒用HindⅢ和cspI内切酶进行酶切反应，回收得到带有酶切位点的Nos基因；再将所述的35SBar-PGreen0229质粒载体用HindⅢ、cspI内切酶进行酶切反应，回收得到大小约为5804bp的片段；之后将该带有酶切位点的Nos基因和大小约为5804bp的片段进行连接反应，得到Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体；上述Nos基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：3所示；该Nos基因由生工生物有限公司合成并连接在puc57质粒上，以puc57-Nos质粒的形式购买得到。③将EXP18-D基因连接到上述Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体，得到EXP18-D-Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体：先将puc57-EXP18-D质粒用HindⅢ内切酶进行酶切反应，回收得到带有酶切位点的EXP18-D基因；再将该Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体用HindⅢ内切酶进行酶切反应，回收得到大小约为6026bp的片段；之后将该带有酶切位点的EXP18-D基因和大小约为6026bp的片段进行连接反应，得到EXP18-D-Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体；上述EXP18-D基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：4所示；该EXP18-D基因由生工生物有限公司合成并连接在puc57质粒上，以EXP18-D-puc57质粒的形式购买得到。④将CKX3基因连接到上述EXP18-D-Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体，得到CKX3-EXP18-D-Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体：先将puc57-CKX3质粒用speI和NotI内切酶进行酶切反应，回收得到带有酶切位点的CKX3基因；再将EXP18-D-Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体用speI和NotI内切酶进行酶切反应，回收得到大小约为88028bp的片段；之后将带有酶切位点的CKX3基因和大小约为8028bp的片段进行连接反应，得到CKX3-EXP18-D-Nos-35SBar-PGreen0229质粒载体，即CKX3基因的植物表达载体。该CKX3基因的植物表达载体的图谱如图1所示。上述构建CKX3基因的植物表达载体的酶切反应中，酶切体系均为：10×buffer：2μl；内切酶：2μl(双酶切时，两种内切酶各1μl)，质粒：10μl，ddH2O；6μl；于37℃反应3小时；上述构建CKX3基因的植物表达载体的连接反应中，连接体系为：10×buffer：1μl，分子量大的片段：1μl，分子量小的片段：7μl，T4DNA连接酶：1μl；16℃连接过夜；以上使用的各种限制性内切酶、T4DNA连接酶均购自Takara公司。上述植物表达载体的原始载体为pGreen0229，是转化拟南芥和其他植物的通用载体，来自拟南芥植物目的基因CKX3插入在SpeI/NotI；该植物表达载体安全性强；上述启动子为EXP18-D，是来自水稻根特异启动子；终止子为Nos，为根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区胭脂碱合成酶基因终止子，用于终止CKX3基因转录。方法二：上述植物表达载体也可以通过以下方法构建：利用PGM-35SBar通用载体(构建方法记载于《PGM-35Sbar玉米通用表达载体的构建及玉米转化研究》，王霄汉等安徽农业科学2012，40：12367-12370)，用根特异启动子EXP18-D在HindIII位点替代UBQI启动子，将目的基因CKX3插入位于SpeI/NotI酶切位点之间，经测序验证正确。上述方法一和方法二构建的植物表达载体图谱如图1所示。⑤将上述两种方法中的任意一个构建的CKX3基因的植物表达载体进行转化处理、振荡培养处理、质粒提取处理、酶切反应，以验证该植物表达载体构建正确：该转化处理为：取该CKX3基因的植物表达载体5μl加入100μl大肠杆菌感受态细胞DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30分钟；再42℃热激45秒，冰上放置2分钟；再加入500μlLB无抗培养基，于37℃转速150rpm振荡培养1小时；再以转速4000rpm离心5分钟，用枪吸掉400μl左右上清液，余下的用涂布棒涂布在含50mg/L的卡那霉素(Kan)的培养基上；再于37℃过夜培养，得到单菌落。该振荡培养处理为：分别挑取上述生长出的单菌落，加入LB液体培养基，37℃过夜振荡培养。该质粒提取处理为：将上述过夜振荡培养的菌液用宝生物工程(大连)有限公司的DV801A型质粒DNA小量纯化试剂盒进行质粒提取处理，得到植物表达载体。该酶切反应为：将提取到的植物表达载体用内切酶SpeI和NotI进行酶切反应，得到酶切产物，酶切体系与步骤④中相同；再将酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图2所示，泳道1-4中为酶切产物，条带由上至下分别为8.4kb左右的大片段和1.6kb左右的小片段，可以证明该植物表达载体构建正确。实施例2：本实施例是将实施例1制备的植物表达载体作为模板，进行PCR扩增反应，得到筛选表达盒的线性DNA，再将该线性DNA经过花粉管通道法转入玉米178中，包括如下步骤：(1)线性DNA的制备：筛选表达盒的线性DNA(该线性DNA包括目的基因和除草剂筛选基因的完整表达盒)，通过以实施例1制备的植物表达载体为模板，采用PCR扩增的方法获得。其中，PCR扩增的引物为：上游引物(LacZ-F1)(序列表中SEQIDNO:5所示):GTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGT；下游引物(RB-R)(序列表中SEQIDNO:6所示):GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCA。PCR扩增反应的程序如下：96℃预变性4min；98℃变性10s，56℃退火15s，72℃延伸7min(因为待扩增片段的长度为5.6kb，为了保证准确度，该PCR扩增反应采用带校正功能的高保真Taq酶，扩增速率较慢；所以该延伸时间较长)，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；PCR扩增反应的反应体系如下(以50μl体系为例)：模板(0.2ng/μl)1μl，5×PrimeSTARBuffer10μl，dNTP(各2.5mM)5μl，上游引物(10μM)1μl，下游引物(10μM)1μl，PrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μl)1μl，ddH2O加至50μl。将获得的线性DNA用无菌ddH2O调整浓度，得到浓度为30ng/μl的线性DNA溶液。(2)花粉管通道法转化玉米：①在玉米开花期时，选择发育正常的植株进行套袋授粉处理；②在上述的授粉处理后20h，对玉米植株的花穗按照如下方法进行修剪处理：先将玉米植株的雌穗上的纸袋摘下，用剪刀剪去大约距离穗轴顶端1～2cm的花丝和苞叶，保持花丝切面平齐，并使苞叶内的花丝略高于苞叶；③然后用一次性针管在上述修剪处理形成的切口处滴注200μl浓度为30ng/μl的线性DNA溶液，立即重新套上纸袋，记录转化的时间及线性DNA名称。实施例3：待实施例2的转化后的玉米果穗成熟时，将其收获晒干脱粒，得到转化种子；该转化种子播种后，在苗期3-5叶期喷洒200mg/L百速顿草铵膦除草剂，获得抗性植株(部分株系命名为120-15，140-7，167-4，261-3，262-1，276-3，278-1，285-11，288-1，288-6、295-1)用于分子检测。转基因株系自交扩繁到T3代获得纯合株系。为了确定上述CKX3基因已经整合进玉米基因组中，对上述抗性植株进行PCR检测、Southern杂交检测。(1)PCR扩增反应检测：根据CKX3基因的DNA序列组成设计引物，引物序列如下：引物1(上游引物)(序列表中SEQIDNO:7所示)：5’TCGCGGTGTTAGGAGG3’，引物2(下游引物)(序列表中SEQIDNO:8所示)：5’TAGGAAATCCATATACGTCA3’采用SDS微量法提取玉米叶片的DNA，然后以此DNA为模板，以上述引物1和引物2为引物，用PTC-100PCR扩增仪(M.J.Research公司)扩增CKX3基因片段；50μl的PCR扩增反应体系为：10×PCRbuffer5μl，2mMdNTP5μl，50μM的引物1和引物2各1μl，模板DNA(1μg/μl)1μl；TaqDNA聚合酶2.5μl；加水至50μl；PCR扩增反应条件为：先94℃5min；然后94℃1min，57℃1min，72℃2min，共30个循环；最后72℃7min。PCR反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示，可见泳道1-4中，阳性转基因植株可扩增出403bp的片段(泳道M：DNA标准分子量；泳道P：质粒，泳道N：非转基因植株，泳道1-4：转基因植株；泳道1：株系278-1；泳道2：株系285-11，泳道3：株系288-1，泳道4：株系140-7。)。(2)Southernblot杂交检测：采用DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitII试剂盒(Roche公司)，对经PCR检测获得的部分阳性转基因株系进行Southernblot分析，具体方法为：采用CTAB大量提取法提取叶片的基因组DNA，取60μg玉米基因组总DNA经限制性内切酶BamHI(TaKaRa公司)完全消化后，用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离，电泳结束后，利用毛细管转移法将DNA转移至带正电荷的Hybond-N+尼龙膜上，所用探针为CKX3核苷酸序列，用琼脂糖凝胶电泳回收该DNA片段后对其进行标记，探针标记操作流程按上述试剂盒的使用说明书进行。检测结果如图4所示(泳道M：DNA标准分子量；泳道WT：对照非转基因植株；泳道L3：株系278-1，泳道L4：株系285-11，泳道L8：株系288-1，泳道L9：株系140-7)，结果转基因玉米存在CKX3的杂交信号，而对照非转基因植株则无此杂交信号，表明外源DNA已经整合到玉米的基因组中。(3)转基因玉米植株性状检测：①对照和转基因株系在旱棚中的生长情况：对照和转基因株系材料在北京塑料旱棚中按株距40厘米、行距60厘米进行播种，3叶期间苗，播种后30天内不浇水，到第30天充分浇水一次之后到收获不再浇水；如图5所示，生长60天的植株(左侧为对照植株，右侧为转基因植株)，转基因植株的株高和长势远远好于对照组植株，这说明转基因植株的抗旱性显著高于对照组植株。②对照和转基因株系的根长的比较：在普通日光温室中采用盆栽试验，在每个直径20厘米高40厘米的花盆填充营养土中播种10粒对照或转基因玉米的饱满种子，每个转基因材料或对照5个重复，充分浇水等种子出苗后长到3叶期进行间苗，每个花盆中留下3株长势一致的幼苗，每3天浇水1次，保证花盆中有充足水分供应。等幼苗长到5叶期时，用水小心冲走营养土，留下玉米植株完整根系进行拍照，并对每个植株整个根系的每个侧根进行长度测量，所有侧根的长度之和作为玉米单株的总根长，重复3次以上试验，对取得数据进行统计分析。如图6所示，盆栽5叶期时转基因株系278-1的根长可达到45cm，而对照植株的根长仅能达到25cm，比对照组植株增加80％(图6中，CK代表对照组，其余均为转基因植株)。如图7所示，*表示转基因植株与对照组植株相比有显著差异，**表示转基因材料与对照相比有极显著差异(图7中，CK代表对照组，其余均为转基因植株)。③转基因株系的株高和叶面积比较：对照组和转基因株系材料在北京塑料旱棚中按株距40厘米行距60厘米进行播种，播种后30天内不浇水，到第30天充分浇水一次之后到收获再不浇水；出苗长到3叶期时进行间苗，此时开始测量每个植株高度，以后每隔7天进行植株高度测量，叶面积为间苗14天后开始测量，也是每隔7天进行叶面积的检测。如图8所示，转基因株系的株高均明显大于对照组(图8中，CK代表对照组，其余均为转基因植株)；如图9所示，转基因株系的叶面积也均明显大于对照组(图9中，CK代表对照组，其余均为转基因植株)。④转基因株系结实情况比较：对照和转基因株系材料在北京塑料旱棚中按株距40厘米行距60厘米进行播种，3叶期间苗，播种后30天内不浇水，到第30天充分浇水一次之后到收获再不浇水；如图10所示，生长110天的植株，在干旱处理条件下转基因植株的结实率比对照组植株显著提高(图10中，CK代表对照组植株，278-1为转基因植株)。转基因株系自交扩繁到T3代获得纯合株系，从268个抗性株系进行除草剂筛选获得179个纯合系，在3米长、3米宽和1米深的水泥旱池进行抗旱鉴定；播种前对旱池土壤充分浇水，然后整个玉米生长季不再浇水，按每个旱池播种3个转基因材料和1个对照，每个材料10株，也就是株距30厘米行距60厘米，并进行自然授粉，130天后统计每个材料每穗平均结实率，对照组的平均结实率为70粒/穗，转基因株系中，有11个株系结实大于200粒/穗，17个株系结实大于150粒/穗，部分株系的结实情况如图11所示，每行左侧的玉米穗为对照组玉米的，右侧的玉米穗为转基因株系的(从上至下编号分别为261-3，276-3和278-1)，可见转基因株系的结实率均明显高于对照组。由实施例1-3可以看出，发明人通过采用来自单子叶植物水稻的根特异启动子EXP18-D来驱动CKX3表达在玉米自交系中，获得了178个纯合株系(T2代除草剂筛选不再分离)，筛选出了抗旱性显著增加的转基因株系。观测苗期转基因株系的根生长量大于对照野生型，在旱棚控水试验中转基因株系抗旱性显著增加，结实率也有明显提高。植物干旱应答的基因超过1000多个，选择哪类或哪个基因进行作物的抗旱改良一直是困扰科学界的一个难题，本发明的发明人证实了通过在根中特异表达CKX3基因可以促进玉米根系生长发育，从而提高玉米的抗旱性，而不影响玉米在正常有水分条件下的生长发育。转CKX3基因促进了玉米根系生长发育，增加了根长及侧根数，健壮根系提高了玉米的抗旱性，增加了在干旱条件下玉米的产量，在水分充足条件下，转基因玉米产量与对照相比也是增产的。显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。