一种利用果胶酶提取马齿苋多糖的方法与流程

本发明涉及一种多糖的提取方法，特别涉及一种利用果胶酶提取马齿苋多糖的方法。
背景技术：
：马齿苋(PortulacaoleraceaL.)为马齿苋科马齿苋属草本植物，作为传统药用植物,马齿苋首见于<本经集注>，后收入<中华人民共和国药典>。本品味酸性寒，归肝、大肠经，具有清热解毒、凉血止血的功效。现代药理学研究表明:本品有降血脂、抗衰老、提高人体免疫力的作用。马齿苋含有约3％的糖类成分，然而相关报道却不多见。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种利用果胶酶提取马齿苋多糖的方法，该方法提取的马齿苋粗多糖具有较好的抗氧化性。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用果胶酶提取马齿苋多糖的方法，该方法包括如下步骤：a、新鲜马齿苋→洗净→50±1℃烘干→粉碎→石油醚脱脂→50±1℃烘干；b、超纯水加酶浸提：取步骤a得到的干燥马齿苋与水混合，调体系pH至4.8-5.2，加入果胶酶液进行提取，25-40℃酶解1-2h，得到酶解液；c、酶解液于100℃的沸水浴下使酶失活，离心分离后得到含有马齿苋多糖的浸提液。作为优选，果胶酶与马齿苋的质量比为0.006-0.01：1。进一步的，果胶酶与马齿苋的质量比为0.007-0.008：1。作为优选，所述的酶解时间为75-85min。作为优选，所述的酶解温度为28-32℃。作为优选，步骤b中，干燥马齿苋与水的质量比为1:38-42。本发明的有益效果是：本发明优化了果胶酶提取马齿苋多糖的工艺，可以高效提取马齿苋多糖。与热水浸提、木瓜蛋白酶解法、纤维素酶解法和超声波提取的多糖相比，果胶酶提取的多糖对超氧阴离子自由基(O2-·)清除能力最强，同这几种方法提取的马齿苋粗多糖对Fe3+和Ce4+的还原能力：热水提取最强，其次是果胶酶。本发明制得的马齿苋多糖具有-对Fe3+和Ce4+的还原能力强、对羟基和超氧阴离子自由基的清除率高的抗氧化性好，与热水浸提和超声波辅助提取相比具有耗能低的优点，其抗氧化活性优于VC。附图说明图1是酶用量对多糖得率的影响曲线；图2是酶解pH对多糖得率的影响曲线；图3是酶解时间对多糖得率的影响曲线；图4是酶解温度对多糖得率的影响曲线；图5是Y1＝f(AB)响应曲面图；图6是Y1＝f(AC)响应曲面图；图7是Y1＝f(BC)响应曲面图；图8是Y2＝f(AC)响应曲面图；图9是Y2＝f(AB)响应曲面图；图10是Y2＝f(BC)响应曲面图；图11是马齿苋多糖提和Vc的·DPPH清除率对比曲线；图12是马齿苋多糖和Vc对Ce(IV)的还原能力对比曲线。具体实施方式下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。马齿苋采自嘉兴有机农业示范园。葡萄糖、浓硫酸、苯酚、氢氧化钠、无水乙醇、95％乙醇、浓磷酸、浓盐酸、水杨酸、双氧水、硫酸亚铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠，铁氰化钾，三氯乙酸，三氯化铁，上海联试化工试剂有限公司；Ce(SO4)2·4H2O，北京康普汇科技有限公司；抗坏血酸，天津博迪化工股份有限公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)，上海伯奥生物科技有限公司；邻苯三酚，遵义林源医药化工有限责任公司；等均为分析纯。果胶酶(含量99％)，无锡百瑞多化工产品有限公司。CP225D型1/10万电子分析天平，德国SATORIOS公司；JP-500B-2型多功能粉碎机，上海市久品工贸有限公司；UV-1102Ⅱ型单光束紫外/可见分光光度计上海天美科学仪器有限公司；DK-S24型恒温水浴锅、DGG-9240BD型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；Millipore超纯水仪、SmartparkDQ3纯水柱，美国。本发明实施例中采用的马齿苋多糖含量测定和羟自由基(·OH)消除率的测定方法如下：①马齿苋多糖含量测定采用苯酚一硫酸法，以葡萄糖作为标准品，分光光度计测定多糖含量。标准曲线准确称取105℃干燥恒重的葡萄糖标准品0.2g,用超纯水溶解至100mL容量瓶中定容,吸取5mL此溶液再定容于100mL容量瓶中,得到浓度为0.1mg·mL-1的标准葡萄糖溶液。准确吸取标准溶液0(空白)、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL分别置于具塞试管中,加超纯水使体积为2.0mL,再加入体积分数6％的苯酚溶液1mL,摇匀,迅速加入浓硫酸5.0mL，振摇5min，置沸水浴中加热15min，再置冷水中冷却，于490nm处测定吸光度A,以糖浓度(c)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线,得标准曲线的回归方程和相关系数。浸提液中多糖含量的测定取浸提液,按标准曲线项下方法操作,测定吸收值,从回归方程中求出浸提液中葡萄糖的含量,按下式计算样品中多糖含量。粗多糖得率(％)＝C×n×V×100％/(W×103)，C为吸光值对应的葡萄糖标准曲线上质量浓度(mg/mL)；n为稀释倍数；V为多糖溶液体积(mL)；W为样品量(g)。②羟自由基(·OH)消除率的测定本实验采用了水杨酸捕获法，其原理是利用H2O2和Fe2+在水溶液中发生Fenton反应，生成羟自由基(·OH)，反应方程式:H2O2+Fe2+→Fe3++·OH。水杨酸能够高效地捕捉·OH并生成有色物质，该物质在510nm处有最大吸收峰，通过吸光度的变化可以衡量试样清除羟自由基的能力。以·OH氧化水杨酸所得产物的吸光值表示·OH的多少，吸光值越大，·OH越多。本实验在Smironff等报道的方法的基础上进行了改进，以2.0mmol·L-1FeSO4︰3.0mmol·L-1H2O2︰3.0mmol·L-1水杨酸＝1︰1︰1的比例加入到烧杯中，震荡摇匀(FeSO4与H2O2混匀10min后，加入水杨酸混匀。)。取10mL比色管，每支都加入上述溶液9.0mL，然后分别加入不同浓度的样品溶液1.0mL摇匀，放置30min后以超纯水调零，于510nm处测得其吸光度Ai，不加样品只加超纯水的比色管检测吸光度值为A0。以VC作为阳性对照，每个浓度平行测3次，求其平均值。按以下公式计算各试样对羟基自由基(OH·)的清除率:清除率按下式计算：清除率(％)＝[1-(Ai－Aj)/A0]×100％式中：A0为不加样品时溶液的吸光度；Aj为不加过氧化氢溶液时的吸光度；Ai为加样品时溶液的吸光度。实施例11.1单因素试验马齿苋多糖提取工艺如下：新鲜马齿苋→洗净→50℃烘干→粉碎→石油醚脱脂→50℃烘干，得到干燥马齿苋→超纯水加酶浸提(恒温)→100℃灭酶10min→离心分离→上清液→测多糖含量。为考察酶用量、酶解pH、酶解时间、酶解温度和料液比对马齿苋多糖得率的影响，进行如下单因素试验。①酶用量对多糖得率的影响称取六份2.000g马齿苋(干燥)，料液比1∶25，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调pH至5.0，分别加入0.0、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030g的果胶酶液进行提取，40℃酶解1h，酶解后在沸水浴中灭酶10min，离心分离后测上清液中多糖的含量(吸光度大多糖含量高)，由图1可知酶添加量为0.02g时为最佳。②酶解pH对得率的影响称取七份2.000g马齿苋，料液比1∶25，酶添加量为0.02g、酶解温度40℃、分别在pH为3.0、3.4、4.0、4.4、5.0、5.4、6.0提取马齿苋多糖，提取时间60min后在沸水浴中灭酶10min后离心分离后测上清液中多糖的含量(吸光度大多糖含量高)，由图2可知pH为5.0.时多糖提取率最高。③酶解时间对多糖得率的影响称取六份2.000g马齿苋，料液比1∶25、pH5.0、酶添加量为0.02g、温度40℃，分别酶解不同时间(30、60、80、100、120、140min)，酶解后在沸水浴中灭酶10min，离心分离测上清液中多糖的含量(吸光度大多糖含量高)，由图3可知酶解时间为80min时多糖提取率最高。④酶解温度对多糖得率的影响称取六份2.000马齿苋，料液比1∶25、pH5.0、酶添加量为0.020g、分别在不同提取温度(35、40、45、50、55、60℃)下提取80min后在沸水浴中灭酶10min，离心分离测上清液中多糖的含量(吸光度大多糖含量高)，由图4可知35℃时多糖提取率最高。⑤料液比对多糖得率的影响称取五份2.000g马齿苋，pH5.0、酶添加量为0.02g、温度35℃分别在不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)下提取80min后在沸水浴中灭酶10min，离心分离测上清液中多糖的含量(吸光度大多糖含量高)，由表1可知料液比为1:30时多糖提取率最高。表1料液比对多糖得率的影响料液比(g·mL-1)1:101:201:301:401:50吸光度(A)0.1960.3020.4160.3820.3501.2响应面法优化果胶酶提取马齿苋多糖的工艺1实验设计采用Design-Expert8.0.6软件，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，结合单因素试验结果，选用酶加量(A)、提取温度(B)、料液比(C)3个对马齿苋多糖提取率影响较大的因素，采用三因素三水平的响应面分析法求取优化的工艺参数，试验因素与水平设计如表2所示，以A、B、C为自变量，以马齿苋多糖提取率(Y1)和对OH的清除率(Y2)为响应值，进行响应面分析试验，实验方案与结果如表3所示。表2响应面的因素与水平表3Box-Behnken设计方案及试验结果2试验结果根据表3进行试验，对试验数据进行多元回归拟合,得马齿苋多糖的提取率(Y1)对酶加量(A)、温度(B)、料液比(C)的二次多项回归模型方程为：Y1＝5.5966-0.03429A-0.4385B+0.2109C-0.1309AB-0.4821AC+0.05611BC+0.3318A2-2.1308B2+0.2030C2由表4可知，模型失拟项，不显著(p>0.05)，说明该二次模型可以较好地描述各因素与响应值之间的关系，能够拟合真实的试验结果。从线性项看,表4中B>A>C，说明酶解温度对多糖的提取率影响最大,其次是酶加量，第三是液比。由表4回归方程偏回归系数显著性检验可知，酶加量(A)、酶解温度(B)和料液比(C)之间存在交互作用，其中酶加量(A)、和料液比(C)的交互作用最大。表4多糖提取率实验结果方差分析表[注]＊：差异显著(P<0.05)；＊＊：差异极显著(P<0.01)。依据回归模型的数学分析确定果胶酶提取马齿苋多糖的最佳工艺参数为：酶解pH为5.0、酶解时间80min、2.000g马齿苋中酶加量为0.015g、料液比为1:40、酶解温度30℃，回归模型预测的马齿苋多糖得率理论值为5.393％。响应曲面图分别见图5、图6和图7。用对OH的清除率(Y2)来进一步验证马齿苋多糖的提取工艺参数的可靠性，结果吻合，酶加量为0.0075g/g、酶解温度为30℃、料液比为1:40g/mL、对OH清除率为64.899％。相应曲面见图8-10。3验证试验以此工艺参数做3次平行试验，多糖得率分别为4.883％、5.362％和5.586.％，平均得率为5.277％，与理论预测值5.393％相比，相对平均偏差为4.98％。可见该模型能较好地模拟和预测果胶酶提取马齿苋多糖的提取效果。马齿苋多糖和Vc抗氧化活性比较：Vc溶液的配制：准确称取0.1gVc，溶解后定容于100mL容量瓶中(浓度为0.1％)，分别移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL定容于10mL容量瓶。马齿苋多糖溶液的稀释：按上述工艺参数提取马齿苋多糖，浸提液定容100mL(浓度为0.053％)，取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL定容于10mL容量瓶。1、对Ce(VI)还原力的测定：采用Cerac法利用Ce(VI)/Ce(III)之间的转化度，评价化合物的总还原能力。用分光光度计测定其吸光度，吸光度越小还原能力越强。检测试剂的配制:称取0.0809gCe(SO4)2·4H2O，加入25mL超纯水，17mL浓H2SO4，搅拌直至完全溶解，转移到100mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，得浓度为2.0×10－3mol·L-1Ce(SO4)2溶液。精确称取35.50gNa2SO4于100mL烧杯中，加水溶解，定容至250mL后，缓慢加入54.64mL的浓硫酸，摇匀，冷却，得到Na2SO4溶液。检测试剂由8.53mLNa2SO4溶液、0.47mLH2O及1.0mLCe(Ⅳ)溶液组成(或由290.02mLNa2SO4溶液、15.98mLH2O及34.0mLCe(Ⅳ)溶液组成)，此时体系含0.3mol·L-1H2SO4，1.0mol/LNa2SO4，Ce(Ⅳ)浓度为2.0×10-4mol·L-1。检测时，以超纯水为参比，波长320nm，在比色管中加入Ce(SO4)210.00mL，分别加入不同浓度的系列样品0.10mL(加液总体积小于试剂量的1/100)，混匀，37℃水浴静置10min后，用石英比色皿测定吸收光谱。所有样品测试过程重复三次，均在室温下进行，见表5。维生素C对照(见表6)。实验中，将Ce(IV)吸光度下降程度(A0－A)/A0定义为还原率α。表5不同稀释倍数的马齿苋多糖的吸光度值表6Vc的吸光度值2、对DPPH自由基的清除能力准确称取51.6mgDPPH少量无乙醇溶解后定容于200mL量瓶，作为储备液(6.5×10-4mol·L-1)储藏在棕色瓶于－4℃的冰箱中，用时取出。利用DPPH·溶液特征紫红色团的在波长517nm下有最大吸收并在加入抗氧化剂提取物后吸收下降表示其对有机自由基的清除能力。分别取2mL不同质量浓度马齿苋多糖溶液(或Vc)及DPPH乙醇溶液8mL，加入同一具塞试管中摇匀，同时以抗氧化剂BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)为阳性对照(浓度同样品)，室温(25℃)避光反应30min后，在517nm波长处分别测定吸光值(以80％乙醇为空白调零)。根据下列公式计算每种提取液对DPPH自由基的清除率:DPPH清除率(％)＝[1－(Ai－Aj)/A0]×100％同法以VC做参照试验。所有测定重复操作3次，取平均值。加样方法见表7-9。表7DPPH试验加样方法吸光度加样值Ao8mL6.5×10-4mol·L-1DPPH溶液+2mL样品的溶剂Ai8mL6.5×10-4mol·L-1DPPH溶液+2mL样品溶液Aj8mL95％乙醇+2mL样品溶液表8不同稀释倍数的马齿苋多糖试液的吸光度值表9Vc的吸光度值图11和图12中所用Vc的浓度接近马齿苋多糖浓度的2倍，由图11可以看出，随着马齿苋多糖和Vc浓度的增加，两者对DPPH清除率也逐渐增加，同样浓度的马齿苋多糖对DPPH的清除能力小于维生素C。由图12可以看出，随着马齿苋多糖和Vc浓度的增加，还原Ce(IV)的能力逐渐增加，并呈现良好的线性关系，马齿苋多糖对Ce(IV)的能力比Vc大得多。综上，酶加量、酶解温度、料液比对马齿苋多糖的提取率的影响不是简单的线性关系，酶解温度对马齿苋多糖的提取率的影响很显著,酶加量对马齿苋多糖得率影响次之，料液比对马齿苋多糖得率影响最小。酶加量(A)、酶解温度(B)和料液比(C)之间存在交互作用，其中酶加量(A)、和料液比(C)的交互作用最大。响应面法优化果胶酶提取马齿苋多糖的最佳工艺条件为:酶解pH为5.0，酶解时间为80min，酶加量为0.0075g·g-1，酶解温度为30℃，料液比为1:40(g·mL-1)，回归模型预测的多糖得率理论值为5.393％％。验证实验马齿苋多糖的提取率为5.277％。回归分析和验证实验表明了该响应面法的合理性和可行性。实施例2一种利用果胶酶提取马齿苋多糖的方法，该方法步骤如下：a、新鲜马齿苋→洗净→50℃烘干→粉碎→石油醚脱脂→50℃烘干；b、超纯水加酶浸提：取步骤a得到的干燥马齿苋与水混合，干燥马齿苋与水的质量比为1:40，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调体系pH至5.0，加入果胶酶液进行提取，果胶酶与干燥马齿苋的质量比为0.0075：1，30℃酶解85min，得到酶解液；c、酶解液于100℃的沸水浴下灭酶，离心分离后得到含有马齿苋多糖的浸提液。实施例3一种利用果胶酶提取马齿苋多糖的方法，该方法步骤如下：a、新鲜马齿苋→洗净→50℃烘干→粉碎→石油醚脱脂→50℃烘干；b、超纯水加酶浸提：取步骤a得到的干燥马齿苋与水混合，干燥马齿苋与水的质量比为1:40，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调体系pH至4.8，加入果胶酶液进行提取，果胶酶与干燥马齿苋的质量比为0.007：1，30℃酶解80min，得到酶解液；c、酶解液于100℃的沸水浴下灭酶，离心分离后得到含有马齿苋多糖的浸提液。实施例4一种利用果胶酶提取马齿苋多糖的方法，该方法步骤如下：a、新鲜马齿苋→洗净→50℃烘干→粉碎→石油醚脱脂→50℃烘干；b、超纯水加酶浸提：取步骤a得到的干燥马齿苋与水混合，干燥马齿苋与水的质量比为1:38，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调体系pH至5.0，加入果胶酶液进行提取，果胶酶与干燥马齿苋的质量比为0.008：1，32℃酶解85min，得到酶解液；c、酶解液于100℃的沸水浴下灭酶，离心分离后得到含有马齿苋多糖的浸提液。以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。当前第1页1 2 3