本发明属于昆虫诱杀控制领域，具体涉及台湾乳白蚁内切葡聚糖酶基因的dsRNA及其应用。
背景技术：
：：白蚁取食木材，是自然界重要的分解者，在世界各地广泛分布，部分白蚁严重危害木建筑材料、木制家具、农林作物等，造成巨大经济损失，被定为有害白蚁，其中主要在亚热带、温带地区分布的台湾乳白蚁(CoptotermesformosanusShiraki)是危害最严重的地下白蚁之一[RustMK,SuNY.Managingsocialinsectsofurbanimportance[J].Annualreviewofentomology,2012,57:355-375.]。木质纤维素是白蚁食物的主要成分，为适应纤维素类食物的消化，白蚁进化出具有高效降解纤维素的纤维素酶系统，包括内切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase，EG)、β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase)和外切葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanase)。因此，抑制这些纤维素酶类的表达，通过饥饿使白蚁群体衰竭，是白蚁防治思路之一。目前常用的白蚁防治药剂或诱饵，以神经毒素、呼吸抑制剂或胃毒剂等化学农药为主，对环境造成破坏，亟需寻找对环境友好、针对性强的有效成分进行补充或替代，改进白蚁防治药物。研究发现，一些糖类抑制剂，如gluconolactone、cellobioimidazole、fluoromethylcellobiose等，能抑制白蚁纤维素消化过程，可作为防治药物的添加成分，但这些药物不是抑制纤维素酶的活性位点，针对性不强[ZhouX,WheelerMM,OiFM,etal.Inhibitionoftermitecellulasesbycarbohydrate-basedcellulaseinhibitors:evidencefrominvitrobiochemistryandinvivofeedingstudies[J].Pesticidebiochemistryandphysiology,2008,90(1):31-41.]。近年来发展的RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术，利用双链RNA(dsRNA)诱发与其序列同源的mRNA分子降解，从而抑制特定基因表达。通过注射和喂食dsRNA实验来研究昆虫的功能基因，发现一些基因的沉默对昆虫的生长发育有显著的影响。因此，利用RNAi效应来抑制昆虫中必需基因的功能进而导致其死亡，减少害虫的危害，这在理论上是可行的。而且RNAi针对性强，只对靶标生物有杀伤性，对其它生物、生态环境影响较少，因而具有极大的发展空间和市场前景。内切葡聚糖酶作用于纤维素及其衍生物，随机水解糖苷键，是纤维素消化的第一步，在降解纤维素过程中起关键作用[杨天赐,莫建初,程家安.白蚁消化纤维素机理研究进展[J].林业科学,2006,42(1):110-115.]，但内切葡聚糖酶基因具有多样性，如果能针对该家族基因进行定向抑制，通过影响白蚁的消化过程，相信能提高防治的效果。台湾乳白蚁中该家族至少有7种编码基因序列，但尚未有针对该家族基因进行RNAi的抑制药物。本发明通过研究台湾乳白蚁内切葡聚糖酶基因的RNAi方法和效果，为台湾乳白蚁的控制提供新途径，也为RNAi理论和技术在害虫控制中提供借鉴，开创害虫控制的新领域。技术实现要素：：本发明的目的是提供一种能够杀死白蚁的台湾乳白蚁内切葡聚糖酶基因的dsRNA。为降低台湾乳白蚁对纤维素的分解能力，替换或减少防治药剂中的有害成分，为昆虫防治提供一条新的途径。本发明的台湾乳白蚁内切葡聚糖酶基因的dsRNA，其特征在于，其正义链的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示的序列，其反义链的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示的序列的反向互补序列。本发明还提供了含有上述台湾乳白蚁内切葡聚糖酶基因的dsRNA的重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒。本发明的第二个目的是提供上述台湾乳白蚁内切葡聚糖酶基因的dsRNA、含有上述台湾乳白蚁内切葡聚糖酶基因的dsRNA的重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒在制备防治白蚁药物中的应用。本发明的第三个目的是提供一种防治白蚁的药物，其特征在于，含有上述台湾乳白蚁内切葡聚糖酶基因的dsRNA、含有上述台湾乳白蚁内切葡聚糖酶基因的dsRNA的重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒作为有效成分。所述的防治白蚁的药物，其还含有农药，如氟虫脲。本发明的dsRNA与氟虫脲联合使用，会对白蚁的存活的影响更大，对酶活的抑制作用更强，从而使得防治效果更佳。进一步优选，所述的防治白蚁的药物中，其台湾乳白蚁内切葡聚糖酶基因的dsRNA的浓度为2μg/cm2，氟虫脲的浓度为0.1μg/mL。本发明经过无数次的实验，发现了对白蚁防治效果非常好的，能抑制台湾乳白蚁内切葡聚糖酶基因家族表达的dsRNA，采用注射或体外饲喂dsRNA方法，无论是单独饲喂dsRNA还是饲喂dsRNA联合其它化合物的混合物，均导致湾乳白蚁内切葡聚糖酶基因表达量降低，产生内切葡聚糖酶活性受到抑制的效应，白蚁死亡率会上升，表明利用RNAi技术能沉默台湾乳白蚁体内内切葡聚糖酶基因的表达，阻碍纤维素的代谢过程，降低台湾乳白蚁的存活率，内切葡聚糖酶基因的dsRNA及含有该成分的产品，可用于白蚁防治药物、抑食剂、消化干扰剂等的研究和应用。附图说明：图1是PCR电泳图，其中M表示DNAMarker，dsCfEG表示产物Cfeg，而dsGFP表示产物gfp；图2是dsRNA注射后台湾乳白蚁Cfeg基因表达检测结果图；图3是dsRNA注射后台湾乳白蚁EG活性变化图：图4是dsRNA喂食后台湾乳白蚁Cfeg基因表达检测结果图；图5是dsRNA喂食后台湾乳白蚁EG活性变化图；图6是各引物的扩增产物的电泳图，其中1、2、3、4表示引物对1、2、3、4扩增的产物，Marker表示DNAMarker。具体实施方式：以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：台湾乳白蚁内切葡聚糖酶家族基因保守片段的制备1.1提取台湾乳白蚁总RNA取台湾乳白蚁工蚁(来自本实验饲养的品系)，使用总RNA提取试剂盒(TIANGEN目录号：DP419)提取总RNA。1.2反转录得到cDNA使用PrimeScriptIIRTase反转录酶(TaKaRa目录号：6210A)，将步骤1.1中得到的总RNA反转录成cDNA，操作步骤参考试剂盒说明书。1.3PCR扩增目的基因片段根据台湾乳白蚁7个已知的EG基因序列(GenBank：AB058667、AB058668、AB058670、AB058669、AB058671、EU853671、GU017483)，确定大小为780bp的保守片段(其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)，且均为编码序列。利用PrimerPremier5.0软件设计如下引物进行PCR扩增：dsCfeg-F：5’-CAAGTGGGTCAGGGAGATG-3’dsCfeg-R：5’-TATGCCTGCTTGCTTGTGA-3’dsCfeg-T7F：5’-taatacgactcactatagggCAAGTGGGTCAGGGAGATG-3’dsCfeg-T7R：5’-taatacgactcactatagggTATGCCTGCTTGCTTGTGA-3’。小写字体是T7RNA聚合酶启动子。选择台湾乳白蚁体内不存在的gfp基因为阴性对照，设计特异性引物用于dsRNA的合成。gfp基因来自于广东省生物资源应用研究所资源昆虫与生物工程研究中心的HT115(DE3)菌株，菌株内含连有gfp基因的L4440质粒。gfp基因也可以根据Genbank的公开序列进行人工或者通过其他手段合成，这属于本领域的常规技术。引物如下：dsgfp-F：5’-TTCCATGGCCAACACTTGTC-3’dsgfp-R：5’-TCAAGAAGGACCATGTGGTC-3’dsgfp-T7F：5’-taatacgactcactatagggTTCCATGGCCAACACTTGTC-3’dsgfp-T7R：5’-taatacgactcactatagggTCAAGAAGGACCATGTGGTC-3’小写字体是T7RNA聚合酶启动子。PCR反应体系(20μL)为：PremixTaq12.5μL，cDNA/GFP质粒1μL，ForwardPrimer1μL，ReversePrimer1μL，ddH2O9.5μL。其中引物F与T7R组对(即dsCfeg-F与dsCfeg-T7R组对、dsgfp-F和dsgfp-T7R组对)，引物T7F与R组对(即dsCfeg-R和dsCfeg-T7F组对，dsgfp-R和dsgfp-T7F组对)，分别进行PCR扩增。PCR程序为：95℃预变性2min(用于gfp基因dsRNA合成的菌液PCR，预变性15min)；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸3min。以白蚁的cDNA为模板，得到473bpPCR产物，经过测序，该473bpPCR产物具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，产物命名为：Cfeg。以gfp质粒为模板，得到502bpPCR产物，gfp核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，产物命名为：gfp。两个PCR产物的电泳图如图1所示。1.4CfEG基因和GFP的dsRNA的制备分别回收上述1.3得到的两种PCR产物Cfeg和gfp，测定浓度，作为体外转录dsRNA的模板。1.4.1转录合成ssRNAssRNA合成体系为：RioMAXTMExpressT72×Buffer10μL、T7EnzymeMix2μL、模板DNA8μL。其中Cfeg和gfp基因的模板DNA分别使用上述方法合成的产物Cfeg和产物gfp。轻柔混匀后稍离心，37℃空气浴转录4h。1.4.2退火合成dsRNA(1)混合转录合成的互补ssRNA，70℃水浴10min，室温冷却20min；(2)在离心管中加入2μL按1：200比例稀释的RNaseSolution和2μLRQ1RNase-FreeDNase；(3)轻柔混匀后稍离心37℃空气浴30min。1.4.3dsRNA的纯化及浓度测定(1)在离心管中加入4.4μL醋酸钠(3M，pH5.2)和44μL异丙醇，混匀，冰浴5min进行dsRNA的纯化；(2)4℃12,000rpm离心10min，吸出上清液；(3)用1mL的75％乙醇，漂洗沉淀1min；(4)4℃12,000rpm离心10min，吸出上清液；(5)室温放置10min，晾干dsRNA沉淀；(6)用50μLRNaseFreedH2O溶解dsRNA，分别得到dsCfeg(以产物Cfeg作为模板)和dsgfp(以产物gfp作为模板)，测定它们的纯度和浓度，-80℃保存待用。将dsCfeg和dsgfp分别测序，结果如下：dsCfeg为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示的序列，其反义链的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示的序列的反向互补序列。dsgfp为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示的序列，其反义链的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示的序列的反向互补序列。实施例2、dsRNA在抑制白蚁纤维素酶中的应用2.1dsRNA注射实验(1)将合成的待注射dsRNA溶液(dsCfeg或dsgfp)用RNaseFreedH2O稀释到指定注射浓度，低温保存备用。(2)将待注射的饥饿处理后的白蚁，进行CO2麻醉；(3)在体视显微镜下分别对白蚁进行对照组ddH2O、阴性对照dsgfp(150ng/头)、处理组dsCfeg1(dsCfEG150ng/头)、dsCfeg2(dsCfEG75ng/头)的显微注射，每组60头，注射量为50.6nL/头；(4)将注射后观察一段时间活性无明显变化的白蚁置于26℃恒温培养箱，每天分别添加一次适量灭菌蒸馏水保持湿润状态，观察取食情况、白蚁活性、记录并清除死亡白蚁。(5)分别在注射后第24h、48h、72h从4组中各随机选取有活性的白蚁，提取总RNA并进行实时荧光定量PCR检测RNAi后相应基因的表达量，测定内切葡聚糖酶(EG)活性。每组设置3个重复。(6)dsRNA注射72h后，台湾乳白蚁的死亡率如表1所示：表1处理组ddH2OdsgfpdsCfeg1dsCfeg2死亡率(％)17.000±1.15516.667±1.20223.667±2.333*22.667±1.453**表示与对照组相比，处理组结果差异显著(P<0.05)。结果显示，注射72h后，注射dsCfEG1及dsCfEG2组白蚁的死亡率显著高于注射dsgfp阴性对照组与ddH2O对照组(P<0.05)。(7)dsRNA注射后台湾乳白蚁Cfeg基因表达检测结果如图2所示：结果表明：注射dsgfp与ddH2O均无显著性差异；注射dsCfeg1和dsCfeg2之后，Cfeg基因mRNA表达水平出现了显著性下调(P<0.05)，其中，注射dsCfeg1(150ng/头)的mRNA表达水平下调效果优于注射dsCfeg2(75ng/头)的抑制效果。(8)dsRNA注射后台湾乳白蚁EG活性变化如图3所示：结果表明注射dsCfeg1以及dsCfeg2后白蚁的EG活性均显著低于对照组(P<0.05)，dsCfeg注射量为150ng/头时对台湾乳白蚁EG活性的抑制效果最好。2.2dsRNA喂食实验(1)选取饥饿处理后的白蚁适量，随机分为4组；(2)将合成的dsCfeg溶液用RNaseFreedH2O稀释到指定浓度，分别用ddH2O和三个浓度的dsCfeg溶液均匀润湿滤纸(60μL/片)，dsRNA浓度依次为0、1、2、5μg/cm2；(3)将4组白蚁置于26℃恒温培养箱，每天分别添加一次适量灭菌蒸馏水保持湿润状态，观察取食情况、白蚁活性、记录并清除死亡白蚁；(4)分别在喂食后第1d、3d、5d、7d从4组中随机选取有活性的白蚁，检测RNAi后相应基因的表达量，测定EG活性。每组设置3个重复。(5)dsRNA喂食7d后，台湾乳白蚁的死亡率如表2所示：表2*表示与对照组相比，结果差异显著(P<0.05)。结果表明喂食7d后，dsCfeg处理组白蚁的死亡率显著高于对照组(P<0.05)，dsCfeg喂食处理后白蚁的活力低于对照组，其中dsCfeg-2μg/cm2处理组活力最低。(6)dsRNA喂食后台湾乳白蚁Cfeg基因表达检测结果如图4所示：结果表明喂食dsCfeg后Cfeg基因的mRNA表达水平均出现了显著性下调(P<0.05)，其中dsCfeg-2μg/cm2处理组的mRNA表达水平下调最明显。(7)dsRNA喂食后台湾乳白蚁EG活性变化如图5所示：结果表明喂食dsCfeg后EG活性均显著低于对照组(P<0.05)；其中dsCfeg-2μg/cm2处理组对台湾乳白蚁EG活性的抑制效果最好。2.3dsRNA对白蚁药物的增效作用用ddH2O、dsCfeg、氟虫脲、dsCfeg+氟虫脲对台湾乳白蚁进行处理，测定白蚁的死亡率、EG活性。具体步骤如下：(1)将100μg/mL的氟虫脲原液用丙酮稀释至10μg/mL的标准溶液，使用时用丙酮稀释至指定浓度；(2)用移液器将丙酮和指定浓度氟虫脲均匀润湿4cm2滤纸(60μL/片)，稍晾干后避光放置2d使丙酮挥发，不滴加氟虫脲的处理选用丙酮预处理的滤纸；(3)喂食每组白蚁的滤纸分别按下表均匀润湿(60μL/处理/片)：具体分组如表3所示表37d后死亡率结果如表4所示：表4可以看出，7天后，3个处理组的白蚁死亡率均显著高于对照组(P<0.05)，其中dsCfeg+氟虫脲处理的白蚁死亡率最高。EG活性变化如表5所示：表5可以看出，3个处理组测定的EG活性均显著低于对照组(P<0.05)，其中dsCfeg+氟虫脲处理的抑制效果最好。以上实验证明，本发明得到的台湾乳白蚁内切葡聚糖酶基因的dsRNA，采用注射和喂食方式均能降低内切葡聚糖酶基因的表达量，抑制纤维素酶活力，促进白蚁的死亡，也能作为有效成分添加到白蚁防治药物中，起到增加防治效果的作用。实施例3基于780bp的保守片段(其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)。本发明还利用PrimerPremier5.0软件设计如下引物进行PCR扩增保守片段中的部分序列，其扩增引物如表6所示：表6以白蚁的cDNA为模板，PCR反应体系(20μL)为：PremixTaq12.5μL，cDNA1μL，正向引物1μL，反向引物1μL，ddH2O9.5μL。PCR程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸3min。电泳结果如图6所示。由图6可以看出，引物对2扩增效果最好，故选来作为后续dsRNA合成的引物。当前第1页1 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