本发明涉及的是基因技术领域的核酸及其引物和检测方法，是一种基于rs6269的检测奎硫平用药效果的试剂盒及其使用方法，更具体地讲是一种分离核酸、一种等位基因特异性的核酸引物和COMT基因rs6269单核苷酸多态性的检测方法。
背景技术：
奎硫平(Quetiapine)化学名为11-{4-[2-(2-(羟乙氧基)乙基-1-哌嗪]}二苯并[b，f][1，4]硫氮杂1/2富马酸盐，分子式C21H25N302S˙1/2C4H404。喹硫平是一种新型的抗精神病药,对多巴胺、5-羟色胺等多种神经递质受体均有相互作用。临床研究表明奎硫平不仅对精神分裂症阳性症状有效，对阴性症状也有一定效果。也可以减轻与精神分裂症有关的情感症状如抑郁、焦虑及认知缺陷症状。常见不良反应为头晕、嗜睡、直立性低血压、心悸、口干、食欲不振和便秘。亦可引起体重增加、腹痛，无症状性ALP增高与血总胆固醇和甘油三酯增高。虽然与经典的抗精神病药相比，喹硫平所致的药物不良反应虽然较少，耐受性较好，但是一旦发生会造成神经系统、肝胆系统、消化系统及心血管系统的严重损伤。研究表明，奎硫平的药效和药物副作用有明显的个体差异，原因是其代谢受到遗传因素及环境因素的影响，但遗传因素是最主要的原因。因此开发更多的与奎硫平代谢相关的分子标记物从而对患者实现个体化治疗是非常有必要的。
COMT(Catechol-O-methyltransferase)基因位于人类第22号染色体q11.21上，在不同的细胞中被翻译成不同长度的蛋白。在大脑的神经细胞中，COMT基因表达为膜结合的儿茶酚-O-甲基转移酶蛋白；大脑中的儿茶酚-O-甲基转移酶蛋白主要分布在前额叶皮质区，它可以保证神经递质如多巴胺等在一个稳定的水平上。在肝、肾及血液等器官中表达为可溶性的儿茶酚-O-甲基转移酶蛋白，它可以催化甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移到儿茶酚胺上，此类物质包括神经递质多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素等。COMT基因在代谢治疗高血压、哮喘、帕金森疾病的儿茶酚药物方面起着重要的作用。由于奎硫平与多巴胺、5-羟色胺等多种神经递质受体均有相互作用，因此寻找奎硫平代谢与COMT基因多态性的关系是现有技术急需解决的难题。
对现有文献的检索，未发现有本发明的COMT基因SNP rs6269为奎硫平分子标记物的相关报道。
技术实现要素：
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种基于rs6269的检测奎硫平用药效果的试剂盒及其使用方法，同时涉及一种分离核酸、一种等位基因特异性的核酸引物。本发明通过关联分析找到了COMT基因SNP rs6269可以作为奎硫平的分子标记物。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种分离的含单核苷酸多态性位点的核苷酸，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO:6所示，所述单核苷酸多态性位点位于第20689位，rs6269为A→G。
第二方面，本发明提供一种所述的核苷酸在制备检测奎硫平用药效果的试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供一种分离的核苷酸，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO：6所示，且第20689位为A。
第四方面，本发明提供一种检测奎硫平用药效果的试剂盒，所述试剂盒包括：根据如SEQ ID NO：6所示序列的第20689位的上下游设计的引物对。
优选地，所述引物对：SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示。
第五方面，本发明提供一种所述的试剂盒的非诊断目的使用方法，包括如下步骤：
步骤一，提取样品DNA；
步骤二，利用所述引物进行扩增，得扩增产物；
步骤三，检测所述扩增产物中是否存在如SEQ ID NO:6所示的单核苷酸多态性位点rs6269。
优选地，步骤三中，所述检测的方法包括：DNA测序、杂交测序、酶促错配切割、异源双链分析、点杂交、寡核苷酸阵列、Mini-sequencing、Taqman技术、分子信标或变性高效液相色谱法。
优选地，步骤二中，所述扩增的具体条件如下：反应体系为20μl，其中含有：
100μmol·L-1dNTPs，50mmol·L-1KCL，10mmol·L-1Tris-HCL(pH8.3)，1.5mmol·L-1MgCl2，0.5U Taq DNA聚合酶，20-50ng模板DNA，0.5μl10pM SEQ ID No.3，0.5μl10pM SEQ ID No.4，双蒸水补足至20ul；
PCR反应条件：95℃2mins；30×(94℃30s；58℃30s，72℃30s)72℃5mins。
第六方面，本发明提供一种用于检测所述核苷酸的SNP位点的引物对，所述引物对：SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示。
与现有技术相比，本发明具备如下优势效果：本发明为研究COMT基因多态性与临床用药安全的关系奠定了基础，为临床用药个体化提供理论基础，同时也为基于药物基因组学理念的新药研发提供指导依据。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常照常规条件，例如Sambrook等人的分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所说的“分离出的或纯化的”是指在基因组DNA水平上，利用引物对来扩增每个多态性位点的基因序列和利用纯化试剂盒对扩增产物进行提纯。
本发明采用的样品来自上海市精神卫生中心的995个精神分裂症患者，年龄18-60岁。全体参与者均由家属在正式的知情同意书上同意签字。
在上述的基础上，本发明采用片段长度差异等位基因特异性PCR(FLDAS-PCR)分型技术对COMT基因的rs6269SNP位点及其频率分布情况进行了检测。已经发现了COMT基因(SEQ ID NO：6)的rs6269第20689位A→G多态性。
具体方法如下：在COMT基因SNP rs6269突变位点处设计引物，引物的3’端按错配碱基的不同设计了两套引物，野生型上游引物在3’端第3位碱基处引入一个碱基错配，在5’端引入5个碱基错配，突变型上游引物在3’端第4位碱基处引入一个碱基错配；下游引物为通用引物。用三对引物扩增目的片段并跑胶检测后发现突变型产物比野生型多5bp，从而实现SNP基因分型。
COMT基因rs6269的cDNA序列列于SEQ ID NO：1，其所编码的氨基酸序列列于SEQ ID NO：2。COMT基因第六号内含子的基因组序列可以从GenBank中获得。
本发明有大量的分析技术可用于检测COMT基因第六号内含子中所述位点是否存在单核苷酸多态性。这些技术包括(但并不限于)：DNA测序、杂交测序；酶促错配切割、异源双链分析、点杂交、寡核苷酸阵列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技术、分子信标等，变性高效液相色谱法(DHPLC)。另一方面，本发明的检测方法被用于评估个体COMT基因SNP rs6269多态性与奎硫平代谢的关系。用于本发明的测试样品没有特别限制，对于检测SNP而言，可以是从血液、组织等样品中抽提出的DNA或mRNA。对于COMT基因第六号内含子活性而言，可以任何含有COMT基因SNP rs6269的样品，如血液等。
本发明为研究我国人群中COMT基因多态性与临床用药安全的关系奠定了基础，为临床用药个体化提供理论基础，同时也为基于药物基因组学理念的新药研发提供指导依据。
更具体地，本发明是通过如下方式实现的：
本发明提供一种核酸的分离和分型：
引物设计：
采用Primer 5.0软件，以GenBank数据库COMT基因(ID:1312，如SEQ ID No.6所示)SNP rs6269附件序列为模板设计一对引物，由Invitrogen公司合成。
引物信息：
扩增COMT基因SNP rs6269位点的DNA序列引物信息：
野生型rs6269-A(SEQ ID No.3)：5’-gacgaACCATCGCCCCCTTGTGaTT-3’
突变型rs6269-G(SEQ ID No.4)：5’-ACCATCGCCCCCTTGTcTTC-3’
通用型rs6269-R(SEQ ID No.5)：5’-GCACCAGAGGGCACGAGAAGGC-3’
PCR扩增条件：(体系各项试剂除DNA外均由ABI公司提供)
100μmol·L-1dNTPs，50mmol·L-1KCL，10mmol·L-1Tris-HCL(pH8.3)，1.5mmol·L-1MgCl2，0.5U Taq DNA聚合酶，20-50ng模板DNA，0.5μl10pM SEQ ID No.3，0.5μl10pM SEQ ID No.4，双蒸水补足至20ul；
PCR反应条件：95℃2mins；30×(94℃30s；58℃30s，72℃30s)72℃5mins。
上述PCR反应完成后，扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显带，可以发现COMT基因SNP rs6269野生型(基因型为A)扩增产物比突变型(基因型为G)多了5bp，因此基因型为纯合个体扩增产物为单一条带，杂合个体为双条带。经过FLDAS-PCR分型发现COMT基因SNP rs6269有多态性(即第20689位A→G)。关联分析发现COMT基因SNP rs6269的G基因型与A基因型患者用氯氮平治疗前后有显著的个体差异，P值为0.008(见表1)。COMT基因CDS及其多态性位点的CDS序列如SEQ ID NO.1所示；COMT基因CDS及其多态性位点的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
综上所述，本发明为研究COMT基因多态性与临床用药安全的关系奠定了基础，为临床用药个体化提供理论基础，同时也为基于药物基因组学理念的新药研发提供指导依据。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
表1