一种多点突变单管快速检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及一种突变检测试剂盒，特别涉及一种多点突变单管快速检测试剂盒。

背景技术：

点突变与许多肿瘤有着密切的关系，已有研究表明，某些基团位点的点突变会使肿瘤的发生率大幅提高。以表皮生长因子受体(EGFR)为例，EGFR是一种人细胞膜表面的糖蛋白受体，该基因位于人类7号染色体，由28个外显子组成。EGFR具有酪氨酸激酶活性，是原癌基因c-erbB1的表达产物，其酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码。EGFR主要通过RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK信号通路和PI3K-PDK信号通路将胞外信号转化为胞内信号，从而对细胞的生长、增殖、分化和凋亡产生作用。

肺癌是我国发病率和死亡率最高的肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占所有肺癌的80％，而我国NSCLC患者中50％以上存在EGFR基因体细胞突变。现有研究表明EGFR基因突变存在多种形式，部分突变与EGFR酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼和厄洛替尼的有效相关，部分突变与EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐药相关。因此，在使用酪氨酸激酶抑制剂进行靶向治疗前，2011年NCCN《非小细胞肺癌临床实践指南(中国版)》推荐进行EGFR基因突变检测，从而基于患者肿瘤DNA中EGFR基因的突变状态来指导临床制定合适的治疗方案。

由于EGFR基因药物敏感的突变点众多，常见的如下表所示：

目前普遍认为需检测28个突变位点。现有市面上的荧光PCR检测试剂盒普遍使用7个PCR管进行检测，分析过程繁琐而且没有必要。同时整个检测流程较慢，至少需要2天才能出结果。

有必要开发出一种更为快速高效的多点突变的检测试剂盒，特别是一种更为快速高效的EGFR多点突变的检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高效的多点突变单管快速检测方法及EGFR多点突变单管快速检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

多点突变单管快速检测方法，包括如下步骤：

1)设计针对不同点突变的ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针；其中，中介连接引物由通用序列部分和特异序列部分构成，通用序列部分与通用荧光探针部分序列互补，特异序列部分与点突变下游的部分序列互补；

2)将ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针与热启动快速Taq酶系统混合，扩增；

3)检测反应体系的荧光变化，确定是否存在点突变。

ARMS引物对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针优为简并的，即一条下游引物、中介连接引物、通用荧光探针可以对应于多条。

作为上述方法的进一步改进，通用荧光探针上连接荧光基团的核苷酸和淬灭探针上连接淬灭基团的核苷酸在互补配对后的间距不超过4个核苷酸，进一步的，不超过3个、2个、1个或连接在相互配对的两个核苷酸上。

作为上述方法的进一步改进，中介连接引物中与突变位点下游的部分序列互补的核酸数量不少于5bp，不少于10bp，特别的，互补的核酸数量为15～30bp。

作为上述方法的进一步改进，中介连接引物中与通用荧光探针部分核酸互补配对的核酸数量不少于5bp，不少于10bp，特别的，互补的核酸数量为15～45bp。

作为上述方法的进一步改进，通用荧光探针的一端连接有保护核酸序列。

本发明的有益效果是：

本发明的发明，操作简单，可以定性检测出多点突变的存在。本发明的检测方法中使用的引物设计难度低，大幅降低了引物合成的成本。

本发明检测方法克服了现有ARMS技术的局限性，大大提高了其检测通量。

本发明的检测方法实现了多管检测反应的简易性，1管反应取代了之前的多管检测。节省人力物力。

附图说明

图1是本发明检测方法的原理图；

图2是等浓度模板在不同Taq酶反应条件下的PCR扩增曲线。

具体实施方式

多点突变单管快速检测方法，包括如下步骤：

1)设计针对不同点突变的ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针；其中，中介连接引物由通用序列部分和特异序列部分构成，通用序列部分与通用荧光探针部分序列互补，特异序列部分与点突变下游的部分序列互补；

2)将ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针与热启动快速Taq酶系统混合，扩增；

3)检测反应体系的荧光变化，确定是否存在点突变。

作为上述方法的进一步改进，通用荧光探针上连接荧光基团的核苷酸和淬灭探针上连接淬灭基团的核苷酸在互补配对后的间距不超过4个核苷酸，进一步的，不超过3个、2个、1个或连接在相互配对的两个核苷酸上。通用荧光探针和淬灭探针也可以是在同一条具有发卡结构的核酸序列。

作为上述方法的进一步改进，中介连接引物中与突变位点下游的部分序列互补的核酸数量不少于5bp，不少于10bp，特别的，互补的核酸数量为15～30bp。

作为上述方法的进一步改进，中介连接引物中与通用荧光探针部分核酸互补配对的核酸数量不少于5bp，不少于10bp，特别的，互补的核酸数量为15～45bp。

互补序列的存在，有利于保证引物间存在足够的亲和力，保证检测结果的可靠性。

作为上述方法的进一步改进，通用荧光探针的一端连接有保护核酸序列。保护序列的作用在于防止探针的关键序列不被反应体系中无意引入的核酸外切酶过早切除。保护序列不与待测序列、引物等互补配对，可以是简单重复序列，如多个A、T、C、G等。

下面结合附图，进一步说明本发明的检测原理。

以EGFR突变点S768I为例，该点的野生型为G，突变型为T，在PCR过程中，首先使用1对引物，含1条针对突变点的ARMS引物(引物最后一个碱基为T)和下游引物。该引物在快速酶的作用下特异性的扩增出突变位点T。野生型位点G不被扩增，如图1a所示；

当特异性扩增发生后，在ARMS引物的引导下，快速Taq酶沿着DNA模板，向5’-3’方向移动并水解中介连接引物的序列介导区域，而中介连接引物的探针互补区域则被释放，如图1b所示；

释放出来的探针互补区域，基于碱基互补配对原则，与通用荧光探针发生互补，在淬灭基团的存在下，荧光基团的荧光被淬灭，如图1c所示；

快速Taq酶通过中介连接引物的探针互补区域，向5’-3’方向移动，水解淬灭基团，从而淬灭基团远离荧光基团，从而PCR反应产生了荧光，如图1d所示。

因此，只要多个个突变位点的ARMS引物、下游引物和中介连接引物，1组通用荧光探针与通用淬灭互补探针，可以置于一个PCR反应管中，即可以检测出样本中是否存在点突变，显著提高了ARMS法的检测通量。

EGFR多点突变单管快速检测试剂盒中使用的ARMS引物的序列如下：

ARMS引物1：TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA(SEQ ID NO：1)

ARMS引物2：TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGT(SEQ ID NO：2)

ARMS引物3：CAAAAAGATCAAAGTGCTGGC(SEQ ID NO：3)

ARMS引物4：TTCCCGTCGCTATCAAAACATC(SEQ ID NO：4)

ARMS引物5：TTCCCGTCGCTATCAAAATATC(SEQ ID NO：5)

ARMS引物6：TTCCCGTCGCTATCAAGACATC(SEQ ID NO：6)

ARMS引物7：TCCCGTCGCTATCAAGTCT(SEQ ID NO：7)

ARMS引物8：CCGTCGCTATCAAGGTACA(SEQ ID NO：8)

ARMS引物9：CGTCGCTATCAAGGCATCTC(SEQ ID NO：9)

ARMS引物10：TCCCGTCGCTATCAAGTCT(SEQ ID NO：10)

ARMS引物11：CCGTCGCTATCAAGGAGCCAA(SEQ ID NO：11)

ARMS引物12：CCGTCGCTATCAAGGAGCAAT(SEQ ID NO：12)

ARMS引物13：CCGTCGCTATCAAGGATCC(SEQ ID NO：13)

ARMS引物14：CCGTCGCTATCAAGGAAGC(SEQ ID NO：14)

ARMS引物15：CCGTCGCTATCAAGGAACCAA(SEQ ID NO：15)

ARMS引物16：CCGTCGCTATCAAGGAACCAT(SEQ ID NO：16)

ARMS引物17：CGTCGCTATCAAGGAATCTC(SEQ ID NO：17)

ARMS引物18：CCGTCGCTATCAAGGAACCG(SEQ ID NO：18)

ARMS引物19：CCGTCGCTATCAAGGAACAG(SEQ ID NO：19)

ARMS引物20：GTCGCTATCAAGGAATCATC(SEQ ID NO：20)

ARMS引物21：CGTCGCTATCAAGGAATCTC(SEQ ID NO：21)

ARMS引物22：GTCGCTATCAAGGAATTCGA(SEQ ID NO：22)

ARMS引物23：AGCCTACGTGATGGCCAT(SEQ ID NO：23)

ARMS引物24：CCAGCGTGGCCAGCGT(SEQ ID NO：24)

ARMS引物25：CCAGCGTGGACGGTAAC(SEQ ID NO：25)

ARMS引物26：GACAATTCCCACCACGTGT(SEQ ID NO：26)

ARMS引物27：CACCGTGCAGCTCATCAT(SEQ ID NO：27)

ARMS引物28：AGATCACAGACTTTGGGCG(SEQ ID NO：28)

ARMS引物29：GTTGGGCTGGCCAAACA；(SEQ ID NO：29)

ARMS引物1和2对应的下游引物为Y1：AGACCATGAGAGGCCCTG(SEQ ID NO：30)；

ARMS引物3对应的下游引物为Y2：AGATGATGGAAATATACAGCTTGC(SEQ ID NO：31)；

ARMS引物4～22对应的下游引物为Y3：TGTGGAGATGAGCAGGGT(SEQ ID NO：32)；

ARMS引物23～27对应的下游引物为Y4：TTGTCTTTGTGTTCCCGGA(SEQ ID NO：33)；

ARMS引物28和29对应的下游引物为Y5：GGCTGACCTAAAGCCACC(SEQ ID NO：34)；

ARMS引物1～3对应的中介引物为Z1：ACCTCGTTCTGGGCTCTACTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATA(SEQ ID NO：35)；

ARMS引物4～22对应的中介引物为Z2：ACCTCGTTCTGGGCTCTACTCCATGGCTCTGAACCTCA(SEQ ID NO：36)；

ARMS引物23～27对应的中介引物为Z3：ACCTCGTTCTGGGCTCTACCTGCCTCCTGGACTATG(SEQ ID NO：37)；

ARMS引物28和29对应的中介引物为Z4：ACCTCGTTCTGGGCTCTACCCATGCAGAAGGAGGCAA(SEQ ID NO：38)。

特通用荧光探针的序列为：TC(dT-FAM)GCGGTGTTGGTGTAGAGCCCAGAACGAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：39)，对应的淬灭序列为：5’-BHQ-CCGCAGA-3’。

实施例1

EGFR多点突变单管快速检测试剂盒，主成分如下：

DNA提取液：

50mM NaOH、10mMTris-HCl(PH8.0)、1％NP-40、6％Chelex、0.1mM EDTA(PH8.0)组成

热启动快速Taq酶系统：

3U的热启动Taq，0.5ul的dNTPs(25mM)

引物：

EGFR多点突变单管快速检测试剂盒使用的ARMS引物及对应的下游引物如下表：

中介连接引物：

通用荧光探针对：

通用荧光探针：5’-TC(dT-FAM)GCGGTGTTGGTGTAGAGCCCAGAACGAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

通用淬灭探针：5’-BHQ-CCGCAGA-3’。

使用方法：

DNA提取：

取2片10μm的FFPE组织切片，刮取下来后放入到1.5ml离心管中，再加入120μl的DNA提取液，100℃煮沸10分钟后，将离心管12000rpm离心5分钟，取10μl的上清加入到PCR反应管中；

快速PCR：

50μl荧光PCR体系中，3U的快速Taq酶，10mM Tris-HCL，50mM KCL，0.5U的UNG酶，0.2mM dNTPS(U)，3mM MgCl₂。通用荧光探针与通用淬灭互补探针各1μm，28个突变位点的ARMS引物、下游引物和中介连接引物各1μm。95度5min后，95℃5秒，58℃31秒，循环数为40循环。

监测反应体系的荧光变化，如存在点突变，则荧光信号会增长，如图2所示。

<110> 广州和实生物技术有限公司

<120> 一种多点突变单管快速检测方法及试剂盒

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<140> CN2014104295064

<141> 2014-08-28

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<170> PatentIn version 3.5

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