一种与香猪产仔数相关的SV5标记及其检测方法与流程

本发明涉及动物分子生物学检测领域，具体来说，涉及一种与香猪产仔数相关的SV标记及其应用技术。
背景技术：
：猪是重要的经济动物，猪繁殖性能的高低直接影响到养殖业的生产效率和经济效益，同时繁殖性状是一个低遗传力的数量性状，主要包括产仔数、产活仔数、初生重、初生窝重、20日龄窝重、断奶头数、断奶重和断奶窝重等指标，如何提高母猪繁殖性能是养猪业健康高效、可持续发展的关键，也是当前遗传育种研究的重点和热点。伴随着基因组学和功能基因学的快速发展，分子标记及其检测技术已经发展到了第三代，主要以单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)、表达序列标签(ExpressedsequenceTag，EST)、结构变异(structurevariation，SV)为主。结构变异SV通常是指获得与缺失变异(PAVs，presence/absencevariants)和拷贝数变异(CNVs，copynumbervariants)，包括大尺度序列的缺失(deletion)、插入(insertion)、复制(duplications)、倒置(inversion)和易位(translocation)等(XiR,2010)。在基因组中结构变异的数目远远小于序列多态，一般SNP的数量在百万数量级，而结构变异的数量为十万数量级，二者相差十倍，但结构变异所占的长度总和、影响的基因组序列变化的却远远大于SNP(Conrad,D.F.,2010)，因而，结构变异对基因组和动物性状的影响的权重可能更大。我们前期应用二代测序技术，选取两个个体作为香猪高产和低产群的代表，进行全基因组SVs检测，发现一个区段的结构变异SV5在香猪群体中有明显的差异，和香猪产仔数存在显著关联。因此建立本发明所描述的一种与香猪产仔数相关的结构变异SV5的检测方法，以期为实施香猪分子辅助育种提供技术支持。检测基因中的结构变异，现有二种技术：PCR技术和分子杂交技术。基于PCR技术的方法有：Pairwise-PCR技术，荧光定量PCR技术，短片段多重定量技术(QuantitativeMultiplexPCRofShortFluorescentFragments，QMPSF)、依赖连接的多重扩增探针杂交技术(MultiplexLigation-DependentProbeAmplification，MLPA)等。荧光定量PCR技术对结构变异不能进行精确的定位；后两种技术QMPSF和MLPA，在通量上有所提高，但将多位点的检测置于同一个体系中，增加了引物设计的难度。基于杂交技术的方法有：Southern杂交、荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)、Southernblotting杂交、多重扩增探针杂交技术(MultiplexAmplifiableProbeHybridization,MAPH)等。杂交技术影响因素较多、时间较长。目前，Pairwise-PCR技术在实际操作中应用更多。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是：提供一种与香猪产仔数相关的SV标记及其应用技术。本发明的技术方案是：一种与香猪产仔数相关的SV5标记，是指猪基因组中，候选区域chr3：58983698-58983852的结构变异，该区域的结构变异是基因组中缺失或不缺失155bp片段。用于检测与香猪产仔数相关的SV5标记的引物对，所述引物对为：正向引物SV5F：GTGGAGCGTCTGGGGAACAT，反向引物SV5R：TGGGAGATGGAAGGTGGAGG。本发明提供用于PCR检测前述与猪产仔数相关的SV5标记的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物SV5F和SV5R。所述试剂盒还包括10×PCRMix、去离子水。本发明提供所述SV5标记在鉴定香猪产仔数中的检测方法。所述检测方法包括以下步骤：(1)提取香猪的基因组DNA；(2)以上述香猪基因组DNA为模板，利用所述引物SV5F和SV5R，进行PCR扩增，检测猪基因组SV5的基因型；(3)根据上述检测结果，如果目的片断纯合缺失，则待测猪有产仔数较高的可能性；如果此片断不缺失，则待测个体有低产仔数倾向。步骤(2)中进行PCR所用的扩增体系以20μL为例：2×PCRMix10.00μLF-primer(0.10μg/μL)0.20μLR-primer(0.10μg/μL)0.20μLgDNA1.00μLddH2O8.60μLTotalVolume20.00μLPCR反应条件为：所述SV5标记在香猪产仔数相关的分子标记辅助选择技术的应用。所述的应用包括以下步骤：(1)采用PCR技术检测候选位点在群体中的结构变异的情况，筛选到与猪产仔数性状相关的SV5标记；(2)根据结构变异SV5进行有高产仔数优势母猪的选育。在本发明的实施例中，以结构变异SV5位点(chr3：58983698-58983852)为候选位点，通过PCR技术检测该位点在群体中的结构变异分布情况；如果待测个体SV5区段有缺失，则待测猪属于有高产仔数优势的个体。该结构变异位点的检出，为揭示猪产仔数分子机理和标记辅助选择的实施提供理论基础。本发明的有益效果：(一)本发明提供的分子遗传标记不受猪的年龄、性别和营养和环境等因素的限制，可用于种猪的早期选择，甚至在刚出生时就可准确地进行后备种猪的筛选，从而提高养猪业的经济效益。(二)检测结构变异的方法准确可靠，操作简便，检测所需的条件普通实验室可以满足。(三)本发明可做为分子标记用于产仔数性状的辅助选择，为猪产仔数的分子标记辅助选择提供技术支持。附图说明图1为本发明实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测SV5基因型结果，M：DL2000DNAMarker；1：DD型；2：DA型；3：AA型；图2为本发明实施例1中Sanger测序比对分析结果。具体实施方式以下实例对本发明做进一步的解释，但不限定本发明的范围，若无特别指明，实施例中所用的技术方法和条件均为本领域技术人员所熟知的技术方法和常规实验条件，或按照相关试剂厂商说明书建议的方法和条件。实施例1为本发明的检测方法，步骤如下：1.猪耳组织基因组DNA提取本方法采用天根生化科技(北京)有限公司生产的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，从猪耳组织中提取基因组DNA，具体方法如下：1)取小于50mg的耳组织置于2μL的离心管中，用手术剪刀充分剪碎；2)加入200μL缓冲液GA及20μL蛋白酶K，漩涡混匀，56℃消化2-4小时(每隔0.5小时混匀一次)至组织块消化完全；3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃消化10min；4)加入200μL无水乙醇，漩涡混匀；5)将消化液倒入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CB3放回收集管中；6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CB3放回收集管中；7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CB3放回收集管中；8)重复操作步骤7)；9)将吸附柱CB3放回收集管中12000rpm空离2min，弃废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；10)将吸附柱转移到干净的2mL离心管中，向吸附柱中间部悬空加入50-200μL洗脱液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min；基因组DNA存在于离心管中TE溶液中，4℃保存备用或-20℃长期保存。11)为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的TE溶液再加入吸附柱CB3中，放置2min，12000rpm离心2min；2.目标序列及参考序列的扩增根据NCBI数据库登录的该区域的序列设计引物，所述引物对为：正向引物SV5F：GTGGAGCGTCTGGGGAACAT，反向引物SV5R:TGGGAGATGGAAGGTGGAGG。以20μL计：10×PCRMix10.00μLUp-primer(0.10μg/μL)0.20μLDown-primer(0.10μg/μL)0.20μLgDNA1.00μLddH2O8.60μLTotalVolume20.00μLPCR反应条件为：本试剂盒所包含的引物符合PCR扩增要求，扩增效果稳定、特异性强，PCR扩增结果可准确反应基因组中目标序列的结构变异情况。3.琼脂糖凝胶电泳检测电泳检测选用1％的琼脂糖凝胶。点样时，用微量加样器将PCR产物5μL，加入点样孔中，同时加入D2000DNAMarker0.3μL对参照，设置电压为120V，时间为30min。电泳完成后，在凝胶成像系统中观察结果，并做好图像的保存。4.Sanger测序为了获得精确的SV5的断点信息，我们通过Sanger测序技术对扩增片段进行序列测定，将序列信息与猪参考基因组序列(ref.Sscrofa10.2)进行同源比对分析，确定SV5区域的精确断点位置和基因组定位。实施例2不同猪结构变异的检测及应用按照实施例1的方法，以猪基因组区域结构变异位点(chr3：58983698-58983852)为候选位点，通过PCR技术检测SV5在群体(香猪480头，其中产仔数高的个体240头，产仔数低的个体240头)中的结构变异情况，480头香猪的血样采自从江县。以SV5候选区域，应用本发明建立检测技术分析群体中的结构变异SV5的分布频率，结果显示香猪群体中存在SV5变异。表1香猪群体中候选SV5位点的基因型频率和等位基因频率检测结果表2香猪SV5位点DD和AA基因型对应的产仔数比较应用本发明建立的检测技术可检测待测个体基因组中结构变异SV5的基因型，不受香猪的年龄、性别、营养和环境等因素的限制，且操作简便，结果准确。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域的技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 2 3