两步乳液PCR的检测方法与流程

本发明属于生物医学与临床医学技术领域，涉及一种两步乳液PCR方法，具体涉及一种用于微量目的基因片段扩增的两步乳液PCR方法。

背景技术：

聚合酶链式反应(PCR）是一种体外放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它的最大特点，是能将的DNA大幅增加。但扩增微量目的片段时，特别是有相似干扰片段存在时，扩增的特异性较差，往往不能扩增出目的片段。现有的PCR改进方法如巢式PCR和有限稀释半巢式PCR法（Anticancer Res. 2007; 27(3B):1459-1463）等。巢式PCR应用两套引物进行两步PCR来扩增特异性的DNA片断，第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异，但巢式PCR仍然不能避免非目的产物和其它杂质的干扰，特别是在目的片段浓度极微量的时候，第一对引物往往不能扩增出来产物。有限稀释半巢式PCR方法通过有限稀释把目的片段稀释10倍，并分成10份，降低了干扰物的比例，并同时进行半巢式PCR，10份中有一份阳性就可说明有目的片段存在。该法结合有限稀释法的抗干扰性和巢式PCR的特异性优点来提高扩增微量目的片段的成功率，虽然在一定程度上提高检出率，但还是不能完全避免非目的产物的干扰。

乳液PCR是在PCR反应前，将包含PCR反应所有成分的水相与油相按一定比例混合，在一定转速搅拌力的作用下形成无数个大小相对均匀稳定且在油相中悬浮的小水滴，由于油相的阻隔，这些小水滴构成了独立的PCR反应空间，使每个乳液颗粒中的PCR反应能够独立进行而互不干扰，同时能有效的把干扰物和模板隔开，相当于无限稀释。其最大特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增，最理想的状态下每个小水滴中只含有一个DNA模板，因此小水滴中的PCR反应不会受到竞争干扰。但当目的片段的模板量较少时只有少量的乳液颗粒中有模板，如只有万分之一的乳液颗粒中有模板时，那么最后的产物总量只有常规PCR的万分之一，不能通过常规电泳等手段进行检测。

Chai C等（Food Science & Biotechnology, 2015, 24:1559-1563.111）通过联合乳液PCR和常规PCR解决乳液PCR在扩增低浓度目的片段时产物量少的问题，提高了检测灵敏度。但该法在第二步扩增前需要先对第一步乳液PCR产物进行乙醚破乳化、试剂盒提纯等操作，这些操作不仅繁琐，而且回收效率等不到保障，产物易丢失，特别是第一步乳液PCR产物量极少时，有可能回收不到产物。

本发明建立的两步乳液PCR方法，第一步通过油包水的乳液PCR把不同的模板分开扩增特异性扩增产物，第二步把油包水的乳液转换成水包油的PCR进行二次扩增，进一步提高产量，提高基因检测的灵敏度。该法不仅具备乳液PCR抗干扰、特异性高的特点，还具备乳液PCR结合常规PCR法高产量的特点，同时还没有应用乙醚破乳化、提纯等过程，不仅简单方便，还更经济。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于微量目的基因片段扩增的两步乳液PCR方法，该法先通过油包水的乳液PCR特异性扩增，少量增加目的片段，接着通过加入不含模板的反应液使油包水转换成水包油的乳液PCR再次扩增，大量增加目的片段，从而提高检测特异性和灵敏度。

为解决上述技术问题，本发明提供两步乳液PCR检测方法，按照下述步骤进行：

（1）油包水乳液颗粒的制备：

水相为PCR反应液，油相组成为在矿物油中加入占总体积为4.5% (v/v) 司盘80、占总体积为0.4% (v/v) 吐温80、占总体积为0.05% (v/v) 聚乙二醇辛基苯基醚，其余为矿物油，3000 rpm漩涡震荡5 min；油包水乳液颗粒的制作：把0.1 mL含模板的PCR反应液，以每滴8~10 μL的速度匀速滴入含0.2 mL油相的2 mL平底冷冻管中，滴入时间控制在1 min左右，同时用搅拌子为8×1.5 mm的磁力搅拌器以1300 rpm的速度搅拌，当水相加完后继续搅拌5 min，得到0.3 mL的油包水乳液，分装入PCR反应管中；

（2）第一步PCR扩增：

把步骤（1）中的分装的装有油包水乳液的PCR反应管，置入PCR仪中进行扩增，如扩增乙型肝炎病毒核酸则扩增条件为94 ℃变性2分钟，然后进入30个循环94 ℃变性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸3 min。；

（3）水包油乳液颗粒的制备：

把步骤（2）中的扩增产物14000g/min，0℃，离心10min，弃上层油相，加入适量步骤（1）中不含模板的PCR反应液，3000 rpm漩涡震荡，当油相充分散开，2000 rpm继续震荡2 min，1000 rpm离心20 s，制成水包油乳化液。

（4）第二步PCR扩增：

把步骤（3）中的水包油乳化液的PCR反应管，置入PCR仪中进行扩增，如扩增乙型肝炎病毒核酸则扩增条件为94 ℃变性2分钟，然后进入30个循环94 ℃变性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸3 min。

（5）2%琼脂糖电泳检测：

60V，40min电泳，凝胶成像仪拍照记录。

其中步骤（1）中水相为，用来检测乙型肝炎病毒核酸时为6.67 μL从人血清提取的病毒核酸模板和上海科华生物工程股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒中的93.33 μL预混反应液。

本发明的有益效果：

本发明建立的两步乳液PCR方法，第一步通过油包水的乳液PCR把模板和干扰物分开，提高扩增特异性，第二步把油包水的乳液转换成水包油的PCR进行二次扩增，进一步提高产量，提高基因检测的灵敏度。该法不仅具备乳液PCR抗干扰、特异性高的特点，还具备乳液PCR结合常规PCR法高产量的特点，同时整个过程中还没有应用乙醚破乳化、提纯等过程，不经简单方便，还更经济。

本发明主要用于低浓度核酸的检测，如临床实验室中应用实时荧光定量PCR定量检测乙型肝炎病毒核酸时，如果结果<500 IU/ml时，不能判定病人血清中是否有乙肝病毒。而本发明具有更高的灵敏度，可作为常规定量PCR的补充，进一步检测乙肝病毒核酸定量检测结果果<500 IU/ml的患者，是否有乙肝病毒。如图1两步乳液PCR方法流程图；如图2常规定量PCR扩增阴性的1号和2号乙肝患者，用两步乳液PCR方法可扩增出明显条带，提示病人血清仍有乙型肝炎病毒。

附图说明

图1为两步乳液PCR方法流程图。

图2为实施例 1 中乙肝病毒核酸检测的两步乳液PCR方法与常规PCR对比，其中1和2为常规PCR检测的1和2号乙肝患者，3和4为两步乳液PCR方法检测1和2号乙肝患者，5和6分别为阳性对照和阴性对照。

具体实施方式

实施例1：

本实施例1提供检测乙肝病毒核酸检测的两步乳液PCR方法与常规PCR法对比，包括如下步骤：

（1）标本来源：选取盐城市第一人民医院PCR室2015年10月26日至2015年10月30日之间，定量结果<500 IU/mL且无扩增曲线的病人血清标本40例。阴阳性对照采用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒内阴阳性对照血清。

（2）核酸提取：应用上海科华生物工程股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒提取核酸，-20℃保存。

（3）常规PCR法检测：3 μL模板和上海科华生物工程股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒中的42 μL预混反应液，加入PCR反应管中，置入PCR仪中，反应条件为94 ℃变性2分钟，然后进入45个循环94 ℃变性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，最后延伸3 min。

（4）两步乳液PCR检测：

1）油包水乳液颗粒的制备：

水相为100μL反应体系为6.67 μL模板加上海科华生物工程股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒中的93.33 μL预混反应液。油相组成为4.5% (v/v) 司盘80、0.4% (v/v) 吐温80、0.05% (v/v) 聚乙二醇辛基苯基醚，其余为矿物油。油包水乳液颗粒的制作：把0.1 mL的PCR反应液，以每滴8~10 μL的速度匀速滴入含0.2 mL油相的2 mL平底冷冻管中，滴入时间控制在1分钟左右，同时用搅拌子为8×1.5 mm的磁力搅拌器以1300 rpm的速度搅拌，当水相加完后继续搅拌5 min，得到0.3 mL的乳化液，分装入3管PCR反应管中；

2）第一步PCR扩增：

把步骤1）中的分装的装有油包水乳化液的PCR反应管，置入PCR仪中，反应条件为94 ℃变性2分钟，然后进入30个循环94 ℃变性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，最后延伸3 min；

3）水包油乳液颗粒的制备：

把步骤2中的扩增产物14000 g/min，0℃，离心10min，弃上层油相，加入33μL预混反应液，3000 rpm漩涡震荡，当油相充分散开，2000 rpm继续震荡2 min，1000 rpm离心20 s，制成水包油乳化液。

4）第二步PCR扩增：

把步骤3）中的水包油乳化液的PCR反应管，置入PCR仪中，反应条件为94 ℃变性2分钟，然后进入40个循环94 ℃变性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，最后延伸3 min，进行扩增；

（5）2%琼脂糖电泳检测：80V，40min电泳，凝胶成像仪拍照记录。

结果分析：

电泳分析结果：从图2可以看出实施例1中检测的两例病人常规PCR扩增均为阴性，而两步乳液PCR方法扩增均为阳性；进一步检测全部40例标本，两步乳液PCR方法有14例（35 %）为阳性，而常规PCR法均为阴性。说明两步乳液PCR方法能进一步提高乙肝病毒核酸的检测率，是临床荧光定量方法很好的补充方法。