前列腺癌的诊疗标记物的制作方法

本发明涉及生物医药领域，涉及前列腺癌的诊疗标记物，具体该标记物为NCRNA00087。
背景技术：
：前列腺癌是常见的男性生殖系统恶性肿瘤之一。世界范围内，前列腺癌发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二，在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害男性健康的肿瘤。亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势，且增长比欧美发达国家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50岁以后发病，95％发生于60岁以上的老年男性，发生率持续地随着年龄增长而增加。前列腺癌早期多无任何症状，即使有所不适，也不足以引起病人的重视，当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与前列腺增生相混淆。在我国约80％的病人首先发现远处转移病灶才发现前列腺癌。此时，病变已达晚期，预后不良。前列腺癌的临床诊断方式目前主要有血清前列腺特异性抗原(PSA)检测、直肠指检、直肠超声波检测、活组织病理检查等。PSA(ProstateSpecificAntigen)为前列腺组织特异性抗原，由前列腺的解剖结构可知PSA通过前列腺导管进入血液和尿液中，一些病例或生理情况下PSA会进入血液中去，如前列腺炎症、尿潴留、前列腺感染、前列腺增生和前列腺癌等，因此通过检测血清PSA水平来预测前列腺癌具有一定的假阳性率。从1991年开始，检测血清中PSA含量用于预测前列腺癌，含量高于4ng/mL认为是前列腺癌阳性，灵敏度79％，特异性20％-59％，平均灵敏度约33％，在浓度4-10ng/mL灰区部分，特异性是最低的，这时往往需要通过侵入性的穿刺活检进行确定，给患者带来极大痛苦及精神和经济负担。所以PSA并不能较好的作为诊断前列腺癌的标志物。直肠指检是最简单、最经济实用的方法，主要通过医生的食指触摸前列腺，用以发现很多无症状的前列腺癌患者，有可能获得早期诊断及根治的机会。但以上的方法都存在局限性。例如直肠指检的局限性主要在4个方面：(1)患者前列腺肿块不大时，易漏诊；(2)部分患者前列腺癌肿大不明显，但已属于晚期，不易根治；(3)患者直肠有疾患时不能使用此检测；(4)医生经验不足时可能有漏诊或者误诊的可能。目前，对于中晚期前列腺癌患者，手术治疗的效果差，大多数采用药物治疗。根据不同的病情可以采用化学药物治疗、外放射治疗、放射性核素内放射治疗以及各种疗法的综合应用等。然而，放化疗药物不仅作用于肿瘤，还可以作用于肿瘤周围健康的组织，因而在杀伤肿瘤的同时，也给机体带来了很大的副作用，最终影响对肿瘤的治疗效果。大量的高通量基因组平台数据表明超过98％的基因组转录产物为不编码蛋白的非编码RNA，其中长非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)是一类长度大于200nt的非编码RNA。越来越多的证据表明lncRNAs在多种生物进程和疾病进展中发挥重要作用，例如免疫反应、细胞分化、代谢、肿瘤发生及发展。lncRNAs因其在致癌与肿瘤抑制途径中显露出的潜在作用而成为肿瘤研究的新热点。因此，本领域迫切需要开发早期判断前列腺癌的特异性标志物，并开发前列腺癌的靶向药物。技术实现要素：为了实现前列腺癌的早期发现，早期干预，本发明的目的之一在于提供一种新的前列腺癌的诊疗标记物NCRNA00087。本发明的目的之二在于提供一种用于检测前列腺癌的诊断试剂盒。本发明的目的之三在于提供一种NCRNA00087抑制剂。本发明的目的之四在于提供一种治疗前列腺癌的药物。为实现上述目的，本发明首先提供一种检测前列腺癌的标记物，所述标记物为NCRNA00087。优选地，所述NCRNA00087在前列腺癌组织中表达上调；优选地，检测NCRNA00087在前列腺癌组织中表达上调的方法包括核酸芯片检测法或荧光定量PCR法。优选地，所述NCRNA00087包括如SEQIDNO:1所示的特异性核苷酸序列。进一步地，本发明提供了一种用于检测前列腺癌的诊断试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增前列腺癌相关lncRNA的引物和说明书，所述前列腺癌相关lncRNA是NCRNA00087。优选地，所述引物具有SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物。优选地，所述的说明书中注明以下内容：当检测对象的前列腺癌细胞或组织中NCRNA00087表达量E1与正常前列腺细胞或组织的NCRNA00087表达量E2之比≥2，则提示该检测对象前列腺癌的几率高于普通人群。所述的E1是检测对象的前列腺癌细胞或组织的NCRNA00087表达量；所述的E2是正常人群的正常前列腺细胞或组织的NCRNA00087表达量。所述的正常前列腺细胞或组织包括癌旁的前列腺细胞或组织。所述的表达量是相对于对照基因(如GAPDH)的相对表达量。优选地，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBRGreen荧光染料。进一步地，本发明提供了一种NCRNA00087抑制剂，所述抑制剂包括NCRNA00087的siRNA。优选地，所述的NCRNA00087抑制剂能够抑制NCRNA00087的表达或者能够抑制NCRNA00087的功能。优选地，所述治疗前列腺癌的抑制剂含有下列中的一组或几组siRNA：SEQIDNO.6和SEQIDNO.7，SEQIDNO.8和SEQIDNO.9。更优选的，所述治疗前列腺癌的抑制剂含有siRNA序列为SEQIDNO.8和SEQIDNO.9。进一步地，上述抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗前列腺癌的生物制剂中的应用。进一步地，本发明提供了一种治疗前列腺癌的药物，所述药物包括上述的抑制剂。优选地，所述的药物还包括药学上可接受的载体。所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。优选地，所述的药物通过选自下组的用药方式进行给药：口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。所述的药物的制剂选自下组：片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、喷雾剂。所述的NCRNA00087抑制剂以0.01-20mg/kg体重的剂量(每次或每天)施用于哺乳动物。所述的哺乳动物包括人、小鼠、大鼠，更佳地，为人。本发明的药物可以是单方制剂，也可以是复方制剂。在复方制剂中，除了含有NCRNA00087抑制剂之外，还可包含其他抗肿瘤化合物，例如化疗剂。代表性的化疗剂，包括但并不限于，烷化剂、抗代谢物、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物以及相关抑制剂、长春花碱类、抗生素、L-天冬酞胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位复合物、大黄素取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及促性腺激素-释放激素类似物。优选的化疗剂包括：5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥沙利铂、卡培他滨、紫杉醇和多西紫杉醇。本发明的有益效果如下：本发明公开了一种与前列腺癌相关的NCRNA00087，并进一步证实该NCRNA00087在前列腺癌组织中表达上调。利用该lncRNA检测前列腺癌不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。附图说明图1NCRNA00087在前列腺癌组织样本和癌旁组织样本中的表达情况。图2NCRNA00087-siRNA显著抑制前列腺癌细胞增殖。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。本发明的发明人对前列腺癌组织样本及癌旁组织样本进行高通量转录组测序，通过生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选lncRNANCRNA00087，现有研究中并没有NCRNA00087和前列腺癌相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了NCRNA00087在前列腺癌细胞中表达上调。本发明的NCRNA00087是在本发明之前的已知lncRNA，其基本信息如下：Genbank登录号：NCBI参考序列:NR_024493.2，来源于人类基因组。本发明还采用RT-PCR方法检测上述lncRNA在前列腺癌组织和癌旁正常组织的表达，并验证了该lncRNA在前列腺癌中表达上调。本文使用的术语“表达上调”指对应于所表达基因的序列，其中序列量的测量证明，与从正常个体或从通过前列腺癌分期确定与前列腺癌不同的已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的同一基因相比，所述基因在从患前列腺癌或通过前列腺癌分期确定的前列腺癌已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的表达水平增加。根据本发明，“表达上调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更高的表达增加，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高或者高于1倍，最高为2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更高。实施例1高通量测序筛选差异表达基因1、取样取2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院泌尿外科手术中获得组织标本27例，所有标本均经病理学检查证实，其中癌旁组织样本8例、前列腺癌标本19例，编号后置-80℃低温冰箱保存。2、对组织样本进行总RNA提取采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：①加入Trizol，室温保存5分钟；②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。3、RNA样品的质量分析RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。4、高通量测序测序平台为Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1，FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了GeneOntology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达NCRNA00087，该lncRNA在前列腺癌组织样本中表达上调。实施例2RT-PCR验证前列腺癌组织及癌旁组织NCRNA00087表达情况1、材料20例前列腺癌组织样本及8例癌旁组织样取自北京协和医院2012至2015年期间泌尿外科手术中前列腺癌样本，对其进行分组及编号。所有样本均经过病理学检查证实。2、方法2.1对组织样本进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。2.2逆转录合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。将获得的cDNA样品稀释10倍后保存在-20℃冰箱备用。2.3Real-TimePCR2.3.1仪器及分析方法用ABI7500型荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCt法进行数据相对定量分析。2.3.2引物设计采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NR_024493.2(NCRNA00087)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：表1引物序列操作过程如下：表2RealTime反应体系组分加入量2×mix10μL上游引物(10uM)0.5μL下游引物(10uM)0.5μL模板2μL加入灭菌蒸馏水至25μL用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，货号4367659)分别对目的基因引物和内参基因引物进行扩增。实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40个循环。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。反应结束后，取5ul的PCR产物进行2％琼脂糖电泳，用快速胶回收试剂盒(invitrogen公司)将大小为313bp的片段进行切胶回收并测序，结果用blast软件进行同源性分析。3、实验结果实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔΔCt×100％，比较NCRNA00087在前列腺癌组织和癌旁组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中NCRNA00087在前列腺癌患组织中的表达水平为癌旁组织的3倍，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析NCRNA00087在前列腺癌患者中表达上调的结果；RT-PCR产物经回收后，在ABI3730全自动测序仪上测序，该313bp的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。用VectorNTIadvance10软件(Invitrogen公司)将该序列与NCRNA00087整个mRNA序列进行比对，比对结果显示，如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列为NCRNA00087基因的一部分序列，符合率为100％。实施例3RNAi干扰NCRNA00087表达及对前列腺癌细胞的影响一、材料1、细胞来源前列腺癌PC-3细胞株购自美国ATCC公司2、siRNA设计与合成依据在线设计软件siDirectversion2.0(http://design.rnai.jp/)，根据基因序列参照NCBI:NR_024493.2(NCRNA00087)，设计相应的siRNA，具体序列见表3。设计后送往合成公司合成。表3siRNA序列列表二、实验方法1、细胞分组C组：空白对照组；C1组：转染脂质体组；C2组：转染非特异性的siRNA-NC组；S1，S2组：转染特异性的siRNA组。2、转染按照LipofectamineTM2000TransfectionReagent提供的步骤进行。(1)将PC-3细胞系接种在6孔板上，使得24小时内细胞汇合达到70％；(2)准备siRNA-LipofectamineTM2000复合物:a.以250μLOpti-MEM稀释5μLLipofectamineTM2000，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。b.实验各组分别取7.5μLsiRNA加入250μLOpti-MEMI中进行稀释，并轻轻摇动将其混匀；c.孵育5分钟后，将稀释的siRNA和LipofectamineTM2000混合后在室温下孵育20分钟。(3)在培养板中的每个孔中都加入细胞、培养基及siRNA-LipofectamineTM2000复合物。然后轻轻摇动培养板，使他们充分混合；(4)放置在37℃，CO2培养箱内孵育48小时，在荧光显微镜下观察细胞转染数量，检测转染效率；(5)转染效率为荧光镜与光镜视野中的细胞数量的比值，细胞的转染效率均达到90％以上，方可以进行后续的实验。计算公式如下：转染效率＝发荧光细胞的数量/相同视野下的细胞数量×100％3、应用Real-timePCR方法检测转染前后NCRNA00087表达的变化(1)标准曲线的构建：选取在50mL培养瓶中正常培养的前列腺癌细胞1瓶，提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于104-101copies/μL的DNA模板，分别加入NCRNA00087引物和内参引物，配制25μL反应体系，使用Real-timePCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到NCRNA00087和内参的标准曲线。(2)Real-timePCR方法检测转染前后NCRNA00087表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进NCRNA00087和内参的Real-timePCR反应，实验重复三次。(3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。三、实验结果分别用2条NCRNA00087的siRNA及对照siRNA转染第一代前列腺癌细胞，结果显示在大量前列腺癌细胞内发现绿色荧光，证明前列腺癌细胞内已经得到了siRNA的转染，然后在荧光镜和光镜下观察前列腺癌细胞数量，进行转染效率的检测，结果显示转染率均达到90％以上。Real-timePCR结果显示，转染非特异性的siRNA-NC组对前列腺癌细胞中NCRNA00087表达无明显抑制作用，和空白对照组无统计学差异，转染的2个NCRNA00087-siRNA组都对前列腺癌细胞中NCRNA00087表达起到一定抑制作用，NCRNA00087-siRNA1和NCRNA00087-siRNA2抑制率分别为60％和69％。实施例4MTT法检测前列腺癌细胞的增殖情况一、MTT法实验步骤1、在96孔板中，按照每孔加入约1x104细胞，然后在37℃5％CO2的条件下培养24小时；2、按照实验分组(以未转染正常细胞为对照组，转染非特异性siRNA-NC组、转染NCRNA00087-siRNA2组为实验组，以只加培养基不加细胞的空白对照孔调零，每组6个重复)继续培养直至适合检测；3、细胞的siRNA转染，转染方法同实施例3。4、接着在37℃，5％CO2及100％湿度的条件下继续孵育适当时间；5、同时用DilutionBuffer将5xMTT稀释成1xMTT；6、接种0h、24h、48h后，在每孔中加入50μL1xMTT，并在37℃条件下孵育4小时；7、吸出上清液后，在每孔中还需加入150μLDMSO，并将其放置在平板摇床上进行摇匀；8、将酶标仪波长设定为570nm，检测每个孔的光密度(OD值)。9、以各孔光吸收值减去空白孔光吸收值的平均值作为实际光吸收值，取平均值，以0h、24h、48h时间点光吸收值作曲线，反映细胞的增殖情况。二、实验结果与未转染对照组相比，转染siRNA-NC对细胞增殖无明显影响，转染NCRNA00087-siRNA2可以明显抑制前列腺癌细胞增殖，可用于前列腺癌药物的制备，抑制率随时间的延长而增加，结果见图2所示。实施例5前列腺癌检测试剂盒基于实施例2得到的引物组，组装本发明所述的用于前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括特异扩增NCRNA00087的引物对如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示，和特异扩增内参基因(GAPDH)的引物对如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示；还包括SYBRGreen聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBRGreen荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mMKCL，2.5mMMgCL2，200mM(NH4)2SO4。通过对引物浓度和退火温度的优化，确定最佳反应体系如表4所示：表4PCR反应体系组分加入量SYBRGreen聚合酶链式反应体系12.5μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μL模板cDNA2.0μL加入灭菌蒸馏水至25μL最佳反应条件为：95℃预变性5min，(95℃变性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。取30例待检测前列腺癌病人的少量前列腺细胞，待检前列腺癌病人为北京协和医院泌尿科就诊前列腺癌患者。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从前列腺细胞中提取RNA，使用试剂盒中试剂，按照最佳反应体系与条件进行PCR反应，使用试剂盒中正常癌旁组织cDNA作为Real-TimePCR定量检测中的对照cDNA，检测组织样本的NCRNA00087相对正常癌旁组织表达量变化，分析检测结果，样本和对照间比较采用t检验，P<0.05为差异显著，判为检测样本阳性。检测结果显示，在30例待检测病人中，有24例病人的NCRNA00087在前列腺细胞表达水平为癌旁组织中的3-5倍。经临床进一步检测，该24例病人确定患有前列腺癌，其他6例没有患有前列腺癌，临床检测结果与本发明制备的试剂盒检测结果一致。据此推断，本前列腺癌的诊断试剂盒可以明确区分出前列腺癌患者，并以此为临床提供诊断线索。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 2 3