一种锦鲤疱疹病毒CPA检测引物及应用的制作方法

本发明属于鱼类病毒检测技术领域，具体涉及一种锦鲤疱疹病毒CPA检测引物，还涉及该引物的应用。

背景技术：

锦鲤疱疹病毒病(Koi herpes virus disease，KHVD)于1998年5月在以色列首次发现，到1999年才确认其病原为锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus，KHV)，又称鲤疱疹病毒III型(CyHV-3)。该病随后在美国、印尼、英国、欧洲大陆、日本等地区都有大面积爆发。2002年首次证实该病已传至我国。KHV主要感染锦鲤、鲤鱼及其普通变种，感染宿主范围十分狭窄，草鱼、鲢鱼、鳙鱼、罗非鱼等长期与病鱼共养，即使温度适宜也不发病。潜伏感染KHV的鱼体并不表现出临床症状，水温适宜就会暴发和死亡。该病具有高度传染性和极强致死率，不仅水平传染，也会垂直传播。近年来给我国锦鲤、镜鲤、普通鲤鱼的养殖造成了巨大的经济损失。我国农业部、国家质量监督检验检疫总局联合公告第2013号公布的《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》里将其列为二类动物疫病，世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的疾病。因此，做好KHV的检测与监控工作是控制KHV传播的首要工作。

目前的诊断方法有细胞培养分离、电镜技术、聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附法(ELISA)、原位杂交技术等，其中PCR和细胞培养技术是OIE推荐的诊断方法。细胞培养法不能直接对病毒进行检测，只能利用细胞培养物的病变特征进行初步判定并进行进一步病毒检测才能进行准确诊断，该方法局限于实验室内；电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长、准确性低。这些方法都有各自的局限性，为了及早发现和确诊锦鲤疱疹病毒病，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法，为疾病的诊断与防控提供技术手段，也为鲤鱼养殖业的健康发展提供技术保障。

进行养殖水体监测和锦鲤疱疹病毒早期检测是降低锦鲤疱疹病毒流行风险、减少锦鲤疱疹病毒病发病导致巨额经济损失的有效手段，所以建立简单、快速、高灵敏的检查方法，并开发适用于现场应用的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒显得尤为重要。

交叉引物恒温扩增技术(Cross priming amplification，CPA)是由杭州优思达公司发明的一种新型的恒温核酸扩增方法(发明专利授权号：ZL 200810134583.1)，针对靶基因设计特异性引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)在恒温条件下反应一小时即可完成核酸扩增反应。通过标记特异性探针使其扩增产物可用一次性核酸检测装置进行检测，有效防止扩增产物带来的污染，减少假阳性结果。该技术作为一种基础方法，在应用到具体 检测对象时，需要针对检测对象基因结构的特点，针对性地选择靶基因及扩增位点，合理设计交叉引物、检测引物及剥离引物以提高方法的特异性与灵敏度，并且优化各引物浓度比例以及反应体系中其他物质的浓度，获得最佳反应条件，进而才能获得较好的检测效果。本发明将该技术应用到KHV的检测中，根据KHV的特点进行方法的优化，建立了KHV的CP A检测方法。本方法通过在引物设计环节进行改进以及对反应体系部分物质浓度进行优化，以提高方法的特异性和检测结果的准确性。本发明具有很高的特异性和灵敏度，快速、简便，结果判定直观、客观、准确可靠，适合锦鲤疱疹病毒病的现场快速检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种锦鲤疱疹病毒CPA检测引物，根据GenBank公布的KH V毒株的Sph基因编码序列(KJ627438.1)设计CPA引物，同时对部分碱基进行改变以避免引物间错配进而提高反应的特异性，利用CPA技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对锦鲤疱疹病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。

本发明的另一个目的在于提供了一种锦鲤疱疹病毒CPA检测引物在制备锦鲤疱疹病毒CPA检测试剂盒中的应用。利用本发明提供的试剂盒，仅需一个金属浴或水浴锅即可在1.5小时内准确检测出样品中的KHV，能检测KHV感染的病鱼组织，能检测KHV感染的细胞培养物(如Koi-Fin细胞)，非常适用于KHV的现场快速检测。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种锦鲤疱疹病毒CPA检测引物：

CPF:5’-GGTCTATGGCGTGCTTCTATGCTGGAACTGGTGA-3’

CPR:5’-CTATGCTGGAACTGGTGAGGTCTATGGCGTGCTT-3’

DF:5’-(Biotin)CGGACCCAGGTTCGC-3’

DR:5’-(FITC)TCGCCCGCTGTAGGAC-3’

DPF:5’-TATCTCGCAGCCGCAC-3’

DPR:5’-GCCACCTTGGACTCTTCG-3’

一种锦鲤疱疹病毒CPA检测引物在制备锦鲤疱疹病毒CPA检测试剂盒中的应用，所述的试剂盒包括：Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶；dNTPs；MgSO₄；Bet aine；交叉引物CPF、CPR；检测引物DF、DR；剥离引物DPF、DPR；核酸检测试纸条。

CPF:5’-GGTCTATGGCGTGCTTCTATGCTGGAACTGGTGA-3’

CPR:5’-CTATGCTGGAACTGGTGAGGTCTATGGCGTGCTT-3’

DF:5’-(Biotin)CGGACCCAGGTTCGC-3’

DR:5’-(FITC)TCGCCCGCTGTAGGAC-3’

DPF:5’-TATCTCGCAGCCGCAC-3’

DPR:5’-GCCACCTTGGACTCTTCG-3’

利用锦鲤疱疹病毒CPA检测引物或试剂盒非诊断性检测锦鲤疱疹病毒的方法：

1、病毒DNA的获取：

2、CPA扩增：

采用25μL反应体系，包括：Reaction Buffer 2.5μL，交叉引物CPF、CPR各1.0μM，检测引物DF、DR各0.5～1.0μM，剥离引物DPF、DPR各0.2～1.0μM，Mg SO₄ 2～12mM，dNTPs 0.2～1.2mM，Betaine 0.7M，Bst DNA聚合酶5.6U，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至25μL。55～65℃的温度范围，反应15～90分钟后，80℃灭活2分钟。

3、检测结果判定，可以用下述二种方法之一进行结果的判定：

1)取扩增产物，用2.0％(W/V)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示CPA特征性梯状条带，则结果为阳性；无任何条带，则结果为阴性。

2)取扩增产物，用核酸检测试纸条检测，仅在质控区C出现一条红线，表示样品检测结果阴性。出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品检测结果阳性。在质控区C无红色线条出现，表明核酸检测试纸条失效，检测结果无效。

以上所述的步骤，步骤2的CPA扩增中，其体系优选为：

采用25μL反应体系，包括：Reaction Buffer 2.5μL，交叉引物CPF、CPR各1.0μM，检测引物DF、DR各0.6μM，剥离引物DPF、DPR各0.4μM，MgSO₄ 8.0m M，dNTPs 1.2mM，Betaine 0.7M，Bst DNA聚合酶5.6U，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至25μL。63℃反应60分钟后，80℃灭活2分钟。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、特异性好，能有效检测出锦鲤疱疹病毒；

2、快速高效，检测时间约1.5小时，非常适用于KHV的现场快速检测；

3、不依赖昂贵的仪器设备和专业检测人员，检测成本低；

4、检测结果判定简单、客观、直观。

5.灵敏度高，可检测至10copies/μL的KHV。

附图说明

图1为一种锦鲤疱疹病毒CPA检测试剂盒及检测结果的特异性示意图。

样品从左至右依次为KHV、CyHV-2、鳗疱疹病毒(AngHV)、GSIV、WSSV、嗜水气 单胞菌(Ah)、空白对照(水)。

图2为一种锦鲤疱疹病毒CPA检测试剂盒检测灵敏度。

样品从左至右病毒DNA标准质粒浓度依次为10⁹copies/μL、10⁸copies/μL、10⁷copies/μL、10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL、空白对照(水)。

具体实施方式

下列实例进一步说明本发明，但不应该当做对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均已公开或来源于商业渠道。

实施例1：

一种锦鲤疱疹病毒CPA检测试剂盒，包括：

Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶(NEB)；dNTPs；MgSO₄；Betaine(Sigma)；交叉引物CPF、CPR；检测引物DF、DR；剥离引物DPF、DPR；核酸检测试纸条(杭州优思达公司)。

CPF:5’-GGTCTATGGCGTGCTTCTATGCTGGAACTGGTGA-3’

CPR:5’-CTATGCTGGAACTGGTGAGGTCTATGGCGTGCTT-3’

DF:5’-(Biotin)CGGACCCAGGTTCGC-3’

DR:5’-(FITC)TCGCCCGCTGTAGGAC-3’

DPF:5’-TATCTCGCAGCCGCAC-3’

DPR:5’-GCCACCTTGGACTCTTCG-3’

实施例2：

一种锦鲤疱疹病毒CPA检测试剂盒中不同引物浓度及比例的优化：

一、取待检样品提取病毒DNA：

取锦鲤疱疹病毒(朱霞,李新伟,王好,等.一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报,2011,33(5):340-343.感染的Koi-Fin细胞)细胞培养液300μL，用试剂或Vi ral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于30μL灭菌水，-20℃保存备用。

二、CPA扩增的反应体系：

采用25μL反应体系，在PCR管中加病毒DNA模板1μL，Reaction Buffer 2.5μL，交叉引物CPF、CPR，检测引物DF、DR，剥离引物DPF、DPR，MgSO₄8.0mM，dNTPs 1.2mM，Betaine 0.7M，Bst DNA聚合酶5.6U，无核酸酶水补足至25μL。同时设置空白对照。

其中交叉引物(CPF、CPR)，检测引物(DF、DR)，剥离引物(DPF、DPR)采用不同的浓度比例：

1)CPF/R：1.0μM，DF/R：0.5μM)，DPF/R：0.2μM

2)CPF/R：1.0μM，DF/R：0.6μM)，DPF/R：0.4μM

3)CPF/R：1.0μM，DF/R：0.7μM)，DPF/R：0.6μM

4)CPF/R：1.0μM，DF/R：0.8μM)，DPF/R：0.8μM

5)CPF/R：1.0μM，DF/R：0.9μM)，DPF/R：1.0μM

6)CPF/R：1.0μM，DF/R：1.0μM)，DPF/R：1.0μM

三、CPA扩增的反应条件：

反应管于63℃温育60min，80℃灭活2min。

四、检测结果判定：

取5μL扩增产物，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示引物浓度组合2扩增效果最好，即：CPF/R：1.0μM，DF/R：0.6μM，DPF/R：0.4μM。

实施例3：

一种锦鲤疱疹病毒CPA检测试剂盒中不同浓度的MgSO₄的优化：

一、取待检样品提取病毒DNA：

制备方法同实施例2。

二、CPA扩增的反应体系：

采用25μL反应体系，在PCR管中加入病毒DNA模板1μL，Reaction Buffer 2.5μL，CPF/R 1.0μM，DF/R 0.6μM，DPF/DPR 0.4μM，MgSO₄，dNTPs 1.2mM，Betaine 0.7M，Bst DNA聚合酶5.6U，无核酸酶水补足至25μL。同时设置空白对照。

其中MgSO₄的浓度分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0mM。

三、CPA扩增的反应条件：

反应管于63℃温育60min，80℃灭活2min。

四、检测结果判定：

取5μL扩增产物，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示MgSO₄的浓度为8.0mM时效果最好。

实施例4：

一种锦鲤疱疹病毒CPA检测试剂盒中不同浓度dNTPs的优化：

一、取待检样品提取病毒DNA：

制备方法同实施例2。

二、CPA扩增的反应体系：

采用25μL反应体系，在PCR管中加病毒DNA模板1μL，Reaction B uffer 2.5μL，CPF/R 1.0μM，DF/R 0.6μM，DPF/DPR 0.4μM，MgSO₄ 8.0mM，dNTPs，Bet aine 0.7M，Bst DNA聚合酶5.6U，无核酸酶水补足至25μL。同时设置空白对照。

其中dNTPs的浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mM。

三、CPA扩增的反应条件：

反应管于63℃温育60min，80℃灭活2min。

四、检测结果判定：

取5μL扩增产物，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示dNTPs浓度为1.2mM时效果最好。

实施例5：

一种锦鲤疱疹病毒CPA检测试剂盒中不同反应温度的优化：

一、取待检样品提取病毒DNA：

制备方法同实施例2。

二、CPA扩增的反应体系：

采用25μL反应体系，在PCR管中加病毒DNA模板1μL，Reaction B uffer 2.5μL，CPF/R 1.0μM，DF/R 0.6μM，DPF/DPR 0.4μM，MgSO₄ 8.0mM，dNTPs 1.2mM，Betaine 0.7M，Bst DNA聚合酶5.6U，无核酸酶水补足至25μL。同时设置空白对照。

三、CPA扩增的反应条件：

反应管分别置于55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃温育60min后，80℃灭活2min。

四、检测结果判定：

取5μL扩增产物，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示反应温度为63℃时效果最好。

实施例6：

一种锦鲤疱疹病毒CPA检测试剂盒的特异性：

1、取待检样品提取病毒DNA或细菌核酸：

KHV(朱霞，李新伟，王好，等.一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报，2011，33(5)：340－343.)感染的Koi-Fin细胞出现90％病变后收获、鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)感染的GiCB(马杰，曾令兵，江南，等.鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用[P].中国发明专利.C12N 5/071；|C12N 7/00；|C12Q 1/02；|A61K 39/245；|A61P 31/22；|C12R 1/91C：2013.12.09。中国典型培养物保藏中心，C CTCC NO:C2013179)出现90％病变后收获、鳗疱疹病毒(Frans Rijsewijk，Sylvia Pritz-V erschuren，Sonja Kerkhoff，et al.Development of a polymerase chain reaction for the det ection of Anguillid herpesvirus DNA in eels based on the herpesvirus DNA polymerase ge ne[J].Journal of Virological Methods，2005，124(1-2)：87－94.)感染的EPC细胞、GSI V(中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO:V201134)感染的EPC细胞、白斑综合征病毒(WSSV)(徐进，范玉顶，周勇，等.常规PCR与巢式PCR法快速检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)[J].淡水渔业，2008，38(6)：52－54.)(上述病毒的制备方法同KH V)，于-80℃至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μL，用Viral DNA K it试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50μL灭菌水，-20℃保存备用。

另外培养分离自大鲵的一种致病菌：嗜水气单胞菌(Ah)(孟彦，曾令兵，杨焱清，等.大鲵腹水病病原菌的分离与鉴定研究[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)，2009，37(3)：77－81.)常规细菌培养，直接以菌液(10⁹CFU/mL)作为模板检测。

2、CPA扩增的反应体系：

采用25μL反应体系，包括：Reaction Buffer 2.5μL，CPF/R 1.0μM，DF/R 0.6μM，DPF/DPR 0.4μM，dNTPs 1.2mM，Betaine 0.7M，Bst DNA聚合酶5.6U，MgSO₄ 8.0mM，模板DNA 1μL，无核酸酶水补足至25μL。

3、CPA扩增的反应条件：

反应管分别置于63℃温育60min后，80℃灭活2min。

4、检测结果判定：

用核酸检测试纸条检测，试纸条下端滴加5～8μL扩增产物，再加缓冲液(杭州优思达公司)3滴，3～5min后可用肉眼判读。核酸检测试纸条显示，针对KHV设计的特异性CP A引物组能保证对KHV的特异性检测，只检测出KHV，而CyHV-2、AngHV、GSIV、WS SV、Ah、空白对照(水)均为阴性(图1)。

实施例7：

一种锦鲤疱疹病毒CPA检测试剂盒灵敏度：

1、KHV Sph基因克隆及标准重组质粒构建：

提取KHV病毒总DNA(制备方法同实施例2)，PCR扩增Sph基因(KJ627438.1)全长序列，并克隆进pMD19-T质粒，构建KHV Sph基因标准重组质粒。提取并纯化重组质粒，测定质粒浓度，计算质粒拷贝数，并用纯水将标准质粒浓度调整到10¹⁰copies/μL。灵敏度测定时，将标准质粒用纯水进行10倍梯度稀释，使质粒浓度范围为10⁹copies/μL～10⁰copies/μL，作为CPA反应的模板DNA。

2、CPA扩增的反应体系：

采用25μL反应体系，包括：Reaction Buffer 2.5μL，交叉引物CPF、CPR各1.0μM，检测引物DF、DR各0.6μM，剥离引物DPF、DPR各0.4μM，MgSO₄ 8.0mM，dNTPs 1.2mM，Betaine 0.7M，Bst DNA聚合酶5.6U，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至25μL。

3、CPA扩增的反应条件：

反应管于63℃温育60min，80℃灭活2min。

4、检测结果判定：

用核酸检测试纸条检测，试纸条下端滴加5～8μL扩增产物，再加缓冲液1～3滴，3～5min后可用肉眼判读。核酸检测试纸条显示能够检测到10copies/μL的KHV(图2)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所

<120> 一种锦鲤疱疹病毒CPA检测引物及应用

<130> 一种锦鲤疱疹病毒CPA检测引物及应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.1

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<213> 人工合成

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<212> DNA

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