与水稻粒长相关的蛋白ZmGL及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及与水稻粒长相关的蛋白ZmGL及其编码基因与应用。

背景技术：

水稻是人类赖以生存的主要粮食作物之一，全球约有一半的人口以稻米为主食。世界稻米的供求矛盾越来越突出，提高产量是当今水稻育种的首要目标。粒重、每穗粒数和每株穗数是决定水稻产量的三个组成部分，其中粒重又由粒长、粒宽和粒厚度决定。粒长不仅作为重要的产量性状成为育种目标，它还影响稻谷整精米率、烹煮特性和适口性等品质和外观，成为品质育种中的主要选择指标之一。如在增加产量的同时，又能提高稻米质量，则是我们生物学家、农学家最为追求的目标。

技术实现要素：

ZmGL基因(GenBank登陆号KT626002)是玉米中功能未知基因，定位于玉米第4号染色体上，无内含子，编码序列(CDS)大小为810bp，编码包含269个氨基酸残基的蛋白(GenBank登陆号AME17989.1)，蛋白质分子量为27.61KD，等电点为9.68。在该蛋白质序列中，带电荷氨基酸70个，酸性氨基酸21个，碱性氨基酸30个，极性氨基酸58个，疏水氨基酸89个。GenBank数据库比对分析发现，ZmGL蛋白序列具有推定的DUF1645保守结构域，预测该蛋白为富含脯氨酸的类受体蛋白激酶PERK7。ZmGL蛋白序列与玉米(XP_008680000.1)、玉米(NP_001145342.1)、玉米(NP_001142435.1)、高粱(XP_002453267.1)、小米(XP_004951972.1)和水稻(NP_001045810.1)蛋白序列的一致性分别达到94％、88％、85％、57％、56％和48％。ZmGL蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示，ZmGL蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示。本发明构建出蛋白ZmGL的表达载体，其序列如SEQ ID NO.1所示，命名为载体pCAMBIA1300+163+ZmGL，将其转化到水稻中表达，发现过量表达玉米ZmGL基因可引起水稻种子极显著增长增重。与野生型相比，转基因水稻粒长增长10.6％，千粒重增重8.4％。因此，蛋白ZmGL编码基因可用于制备与水稻粒长相关的表达载体。蛋白ZmGL可用于制备水稻粒长调控制剂。

附图说明

图1玉米ZmGL基因的PCR扩增产物；M，Marker；1，PCR产物；

图2 ZmGL的pMD18-T质粒酶切分析；M，Marker；C，未酶切质粒作为对照；1、2、3分别代表不同质粒酶切产物；

图3表达载体pCAMBIA1300+163的结构示意图；

图4表达载体pCAMBIA1300+163+ZmGL酶切鉴定。M，Marker；1、2分别代表不同质粒酶切产物；

图5农杆菌介导水稻遗传转化；A，水稻成熟胚愈伤组织的诱导；B，抗性愈伤筛选；C，愈伤分化；D，生根培养；

图6特异潮霉素引物鉴定转ZmGL基因水稻；M，DNA分子量标准；1，无模板对照；2、3，野生型对照；4、5，阳性对照；6-19，转基因植株；

图7野生型与转ZmGL基因水稻农艺性状的比较；Control，水稻野生型；OE，过表达株系；*P<0.05,**P<0.01,Student’s t test。

具体实施方式

基因克隆

PCR克隆引物，PCR等反应实验条件，克隆载体，来源及可能用到的內切酶，cDNA阳性克隆分析

人工合成一对引物，并在其5’端分别加上NcoI和BamHI酶切位点。引物如下：

ZmGLF：5'CCATGG CACTCTACCCCATGTCCG 3'(24)(NcoI)(SEQ ID NO.4)；

ZmGLR：5'GGATCC CGCAATTCTTCAGAATTTGC 3'(26)(BamHI)(SEQ ID NO.5)。

利用此对引物，以玉米的总DNA为模板进行PCR。PCR条件为：热盖温度105℃，预变性95℃5min，95℃变性45s，61℃退火45s，72℃延伸2min，进行34个循环，72℃延伸10min。PCR体系表1：

表1

使用TAE电泳缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳,得到了大约1000bp的片段(图1)，命名为ZmGL。

将上述ZmGL扩增产物用TIANGEN的试剂盒进行胶回收，然后将回收片段连入PMD18-T载体(TAKARA)。连接体系如表2：

表2

连接2个小时，转化E.coli DH5α的感受态细胞，涂板，用氨苄霉素筛选。挑选单克隆，提取质粒后用NcoI和BamHI双酶切鉴定，结果如图所示，均有大约1000bp的目的条带(图2)。送1、2、3号对应的菌液测序，三个测序序列均与ZmGL基因序列一致。

基因功能验证详细过程

表达原载体及来源，表达原载体构建可能用到的內切酶

克隆得到ZmGL基因，将其构建到表达载体，具体步骤如下：将连接有ZmGL基因的克隆载体pMD18-T和表达载体pCAMBIA1300+163(图3)都用BamHI和NcoI进行双酶切并分别回收纯化，然后用T4连接酶连接后转化E.coli DH5α，挑取单菌落扩大培养后抽提质粒，BamHI和NcoI双酶切鉴定，最终获得连接有目的基因的过量表达载体pCAMBIA1300+163+ZmGL(图4)。利用热激法将构建的表达载体转化到农杆菌EHA105菌株中。

基因转化方法，基因转化物种

采用农杆菌介导法将构建的表达载体转化到水稻SR59中，获得过量表达ZmGL基因的水稻转基因株系。该实验过程如下：以SR59成熟种子诱导而来的愈伤组织为受体，经过农杆菌浸染、共培养、2次抗性愈伤组织潮霉素连续筛选(每次2周)、抗性愈伤组织分化、生根、炼苗等步骤获得潮霉素抗性植株(图5)。

转基因植物分子分析

利用潮霉素特异引物，对潮霉素抗性再生植株进行PCR检测(图6)。检测出含潮霉素基因的阳性株系14株。引物如下：

hptF：5'TTTAGCGAGAGCCTGACCTATTGC 3'(SEQ ID NO.6)

hptR：5'CGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTG 3'(SEQ ID NO.7)

转基因植物功能表型(图7)

对野生型和T1代转ZmGL基因水稻的农艺性状进行对比观察和统计分析。与野生型的株高相比，OE-1株系显著低于野生型，OE-2和OE-3株系与野生型无显著性差异。与野生型的分蘖数相比，OE-2株系极显著高于野生型，OE-1和OE-3株系与野生型无显著性差异。与野生型的剑叶长和宽相比，三个株系无显著性差异。与野生型的穗长相比，三个株系无显著性差异。与野生型的每穗粒数相比，三个株系均显著小于野生型。

与野生型的千粒重相比，OE-2株系无显著差异，OE-1和OE-3株系均极显著增重。OE-1株系增重8.4％，OE-2株系增重1.0％，OE-3株系增重8.4％。与野生型的粒长相比，三个株系均极显著增长。OE-1株系增长10.0％，OE-2株系增长8.2％，OE-3株系增长10.6％。与野生型粒宽相比，三个株系无显著性差异。与野生型的粒长宽比相比，三个株系均极显著变大。与野生型的粒厚相比，OE-2株系显著降低3.6％，OE-1和OE-3株系均无显著性差异。