一种适用于规模化生产重组人源胶原蛋白的毕赤酵母发酵培养基的制作方法

本发明属于毕赤酵母高密度发酵表达重组蛋白领域，涉及一种适用于规模化生产重组人源胶原蛋白的毕赤酵母发酵培养基，更具体地，涉及一种适用于工业化规模高密度发酵表达重组人源胶原蛋白的毕赤酵母甲醇诱导阶段的发酵培养基。

背景技术：

毕赤酵母表达系统作为一种新型酵母表达系统，既有原核微生物的特点，又有真核生物的特性，可以对目的蛋白进行糖基化、二硫键形成等翻译后修饰，越来越普遍地用于替代大肠杆菌实现基因操作，表达具有功效性的活性蛋白。迄今为止，已有1000多种外源蛋白在毕赤酵母中实现了成功表达(武婕等，毕赤酵母工程菌高密度发酵研究与进展，《中国生物工程杂志》，2016，第36卷(第1期)，108-114)，一部分已经实现了工业化规模的生产，广泛应用于众多行业。

毕赤酵母高密度发酵表达目的蛋白时，所用培养基及调控策略通常都采用Invitrogen公司的操作手册中的方案，基础盐培养基主要包括硫酸钙、硫酸钾、硫酸镁和甘油等(高敏杰等，重组毕赤酵母生产外源蛋白的过程控制与生理分析的研究进展，《食品工业科技》，2014，第35卷(第24期)，389-395)，调控策略包括甘油长菌体、甲醇诱导产目的蛋白。甲醇诱导阶段是表达目的蛋白的最关键阶段，通常以甲醇为碳源，少数使用葡萄糖、甘油和甲醇双碳源、山梨醇和甲醇双碳源等(Celik E,et.al,Fed batch methanol feeding strategy for recombinant protein production by Pichia Pastoris in the presence of co-substrate sorbitol.Yeast,2009,26(9):473-484.)，因为在甲醇诱导阶段，即高密度状态下，酵母部分或完全丧失了活力，备用碳源有利于保持酵母的活性，促进酵母增殖。

甲醇诱导阶段也是工业化生产的关键控制点，是规模化放大的瓶颈。现有工艺为了获得较高的目的蛋白表达量，甲醇诱导阶段周期较长，常需要持续5天以上(中国专利201110327865.5)，该阶段耗时长，能耗大，操作难度和工作强度大，对工人技能要求高，很难形成稳定的工艺。

技术实现要素：

为了解决毕赤酵母高密度发酵表达重组蛋白的规模化生产中存在的耗时长，能耗大，操作难度大，工作强度大，对工人技能要求高等实际生产问题，本发明提供了一种适用于规模化生产重组人源胶原蛋白的毕赤酵母发酵培养基，该发酵培养基含有代谢调节剂，能够有效调节毕赤酵母的新陈代谢，加快重组蛋白的表达，适用于工业化发酵培养毕赤酵母，实现重组人源胶原蛋白的大规模生产。

本发明的技术方案如下：

一种适用于规模化生产重组人源胶原蛋白的毕赤酵母发酵培养基，由以下组分组成：

所述的代谢调节剂选自柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、丙酮酸中的一种或一种以上，也可以是上述酸的钠、钾盐等简单衍生物，优选为丙酮酸或丙酮酸钠。

所述的代谢调节剂添加量优选为0.1～1g/L。

本发明所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，已于2011年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5021，并在中国专利201110327865.5中充分公开。

与现有技术相比，本发明的毕赤酵母发酵培养基中添加的代谢调节剂，能调节毕赤酵母的新陈代谢，加快重组蛋白的表达，目的蛋白表达量提高了16.5％，同时缩短了甲醇诱导周期，诱导周期可缩短20％，并且降低能耗，减少出错风险，保证稳定的工业化生产。本发明的毕赤酵母发酵培养基特别适用于工业化高密度发酵表达重组蛋白的毕赤酵母甲醇诱导阶段，能够有效降低生产成本，产生显著的经济效益，对于人源胶原蛋白的工业化生产具有十分重要的实际意义。

附图说明

图1为实施例5与对比例的发酵过程中菌体湿重的对比图。

图2为实施例5与对比例的发酵过程中目的蛋白表达量的对比图。

具体实施方式

在本发明的具体实施例中，采用的菌株为表达重组人源胶原蛋白的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，保藏编号为CGMCC NO.5021，保藏日期为2011年6月29日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并在中国专利201110327865.5中充分公开。

所述的PTM1溶液参照Invitrogen公司的操作手册，具体配方为：CuSO₄·5H₂O 6.0g/L；NaI 0.08g/L；MnSO₄·H₂O 3.0g/L；NaMoO₄·2H₂O 0.2g/L；H₃BO₃ 0.02g/L；CoCl₂0.5g/L；ZnCl₂ 20.0g/L；FeSO₄·7H₂O 65.0g/L；生物素0.2g/L；H₂SO₄ 5.0mL/L，用0.22μm的滤膜过滤除菌，室温保存。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。

实施例1

发酵培养基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L；丙酮酸0.01g/L。

将菌种液按10％接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，调节搅拌转速200-600rpm、罐压0.2-1.0bar、调节空气流量使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇，作为新的碳源，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小时进行取样，测定菌体湿重和重组人源胶原蛋白表达量，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为16.5g/L。

实施例2

发酵培养基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L；丙酮酸10g/L。

将菌种液按10％接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，调节搅拌转速200-600rpm、罐压0.2-1.0bar、调节空气流量使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为216g/L，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇，作为新的碳源，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小时进行取样，测定菌体湿重和重组人源胶原蛋白表达量，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为16.1g/L。

实施例3

发酵培养基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L；丙酮酸0.1g/L。

将菌种液按10％接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，调节搅拌转速200-600rpm、罐压0.2-1.0bar、调节空气流量使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为218g/L，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇，作为新的碳源，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小时进行取样，测定菌体湿重和重组人源胶原蛋白表达量，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.7g/L。

实施例4

发酵培养基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L；丙酮酸1g/L。

将菌种液按10％接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，调节搅拌转速200-600rpm、罐压0.2-1.0bar、调节空气流量使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇，作为新的碳源，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小时进行取样，测定菌体湿重和重组人源胶原蛋白表达量，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为18.0g/L。

实施例5

发酵培养基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L；丙酮酸钠0.5g/L。

将菌种液按10％接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，调节搅拌转速200-600rpm、罐压0.2-1.0bar、调节空气流量使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为216g/L，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇，作为新的碳源，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小时进行取样，测定菌体湿重和重组人源胶原蛋白表达量，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为18.4g/L。

本实施例及对比例的取样检测结果见图1和图2。图1为实施例5与对比例的发酵过程中菌体湿重的对比图，从图中可以看出，本实施例诱导时间缩短了20％，即由对比例的120h缩短到了96h；同时本实施例菌体的生长情况优于对比例，新陈代谢更加旺盛，达到相同菌体湿重所需时间减少，最终达到的菌体湿重也更高。图2为实施例5与对比例的发酵过程中目的蛋白表达量的对比图，比较图中数据可知经本实施例的发酵培养基培养后，目的蛋白的表达量较对比例提高了16.5％，由对比例的15.8g/L提高到了18.4g/L。

实施例6

发酵培养基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L；柠檬酸0.5g/L。

将菌种液按10％接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，调节搅拌转速200-600rpm、罐压0.2-1.0bar、调节空气流量使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为219g/L，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇，作为新的碳源，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小时进行取样，测定菌体湿重和重组人源胶原蛋白表达量，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.4g/L。

实施例7

发酵培养基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L；苹果酸0.5g/L。

将菌种液按10％接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，调节搅拌转速200-600rpm、罐压0.2-1.0bar、调节空气流量使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为216g/L，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇，作为新的碳源，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小时进行取样，测定菌体湿重和重组人源胶原蛋白表达量，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.2g/L。

实施例8

发酵培养基：85％H₃PO₄ 6.6mL/L；CaSO₄·2H₂O 0.3g/L；K₂SO₄ 4.5g/L；MgSO₄·7H₂O 3.7g/L；KOH 1.0g/L；甘油10.0g/L；PTM1 0.435mL/L；丙酮酸钠0.5g/L。

将菌种液按10％接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，调节搅拌转速200-600rpm、罐压0.2-1.0bar、调节空气流量使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为216g/L，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇，作为新的碳源，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小时进行取样，测定菌体湿重和重组人源胶原蛋白表达量，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为16.4g/L。

对比例

发酵培养基为基础盐培养基(BSM，参考CN102443057B)：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；PTM14.35mL/L；甘油40.0g/L。

将菌种液按10％接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，调节搅拌转速200-600rpm、罐压0.2-1.0bar、调节空气流量使溶氧(DO)＞30％。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为218g/L，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇，作为新的碳源，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小时进行取样，测定菌体湿重和重组人源胶原蛋白表达量，诱导发酵120h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为15.8g/L。