一种草鱼出血病免疫性状相关的遗传标记的制作方法

本发明属于鱼类遗传标记筛选与制备技术领域，具体涉及一种草鱼出血病免疫性状相关的遗传标记。所述的遗传标记从C7N1基因中得到。本发明还涉及所述遗传标记在草鱼出血病免疫性状的遗传标记中的关联分析的应用。

背景技术：

草鱼(Ctenopharyngodon idella，英文名grass carp)是我国重要的淡水养殖鱼类，其产量约占淡水养殖总产量18％(Rao YL等.2015.Insights into the antiviral immunity against grass carp(Ctenopharyngodon idella)reovirus(GCRV)in grass carp.J Immunol Res,670437)。草鱼出血病是草鱼鱼种阶段最为严重的疾病，该病发病季节长，流行范围广，死亡率高，常给养殖者造成重大的经济损失，其病原为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)，该病毒由11个双链核糖核酸(dsRNA)片段和两层衣壳蛋白组成。随着测序技术的快速发展，新的基因及其功能不断地被挖掘。目前，人、鼠、斑马鱼C7N1基因序列已被报道(Wan D等.2004.Large-scale cDNA transfection screening for genes related to cancer.Proc Natl Acad Sci USA,101(44):15724-15729)，但缺乏对其分子结构与功能的研究。

C7N1基因位于草鱼的7号染色体上，编码蛋白是一种新型蛋白，由993个氨基酸组成。即使在高等哺乳动物中也未见对其生物学功能的相关报道。对C7N1进行生物信息学分析，该基因包含3个外显子，2个内含子，其氨基酸序列与斑马鱼的同源序列相似度为72％，发现其在半胱氨酸和蛋氨酸的代谢途径中发挥着重要的作用。

目前，草鱼免疫相关基因的克隆及其功能的研究取得了很大的进步。在如此丰富的理论研究基础之上，寻求一种高效、可行的方法来选育抗草鱼出血病的品种是必要的。而传统的育种方法耗时、耗力，于是基于遗传标记的育种方法逐渐被研究者采用。水产动物分子育种技术经过数十年的发展，已经进入基因组时代，并朝着分子育种的宏伟目标迈进。随着众多经济生物全基因组测序的完成，如何从海量的基因序列信息中深入地挖掘有用的生物信息迫在眉睫，进而将这些知识转化成技术并被运用在生产实践中。其中，遗传多态性鉴定是后基因组时代研究的一个重点内容。通过关联分析和连锁分析，将基因结构的变异和表型的变异联系起来，寻找经济性状相关的基因和标记，从而将其用于分子遗传育种。在南亚黑鲮上，已经有利用微卫星标记育种方法培育出新品种的报道，并且该报道证明分子遗传育种是一种行之有效的育种方法(Sahu DK等.2013.Identification of reproduction-related genes and SSR-markers through expressed sequence tags analysis of a monsoon breeding carp rohu,Labeo rohita(Hamilton).Gene,524(1):1-14)。2015年1月，童金苟在《Science China Life Sciences》杂志上对重要的经济性状在鱼类分子遗传育种上的运用进行了综述，分析了分子选育的特点，为抗病抗逆品系的选育、疫苗开发和疾病管理提供了重要基础(Tong JG等.2015.Genetic and genomic analyses for economically important traits and their applications in molecular breeding of cultured fish.Science China Life Sciences,58(2):178-186)。同时，比较基因组学在研究中也被广泛地采用。草鱼，斑马鱼和稀有鮈鲫同属鲤科鱼类，但对GCRV的感染表现出不同的抗病性，研究发现草鱼在感染GCRV后死亡率为50～90％，而稀有鮈鲫的死亡率可达100％，斑马鱼不致死。为探索它们的抗病毒免疫机制提供了方向，其中比较基因组学更能广泛地挖掘出这三者在基因水平上的差异，为进一步的研究奠定坚实的理论基础。

相关研究提示我们，可以将基础理论研究与生产实际相结合起来。对草鱼C7N1基因的遗传多态性和草鱼出血病进行关联分析，以期获得抗病相关的遗传标记。在此研究中，早期发展起来的测序和PCR-RFLP技术又为遗传多态性的研究提供了确切的技术保障。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，筛选一种草鱼出血病免疫性状相关的遗传标记。所述的遗传标记从C7N1基因中筛选得到，本发明找到C7N1基因的一个SNP，进一步，本发明的遗传标记可以在草鱼出血病免疫性状的遗传标记的关联分析中应用。

在本发明中，申请人对GCRV感染后的抗性/易感草鱼脾脏、头肾组织和单克隆CIK细胞进行了转录组测序，关联分析发现C7N1基因的一个SNP与草鱼抗性密切相关。感染实验证明：C7N1基因中的碱基突变与草鱼出血病显著相关。

本发明借助高通量测序方法筛选草鱼出血病免疫性状相关的突变位点，利用PCR扩增、Sanger测序技术对候选位点进行验证，利用PCR或PCR-RFLP技术对验证后的位点进行基因分型，将分型结果与自然草鱼群体的草鱼出血病免疫性状进行关联分析，从而鉴定得到与草鱼出血病免疫性状相关的遗传标记，为选育抗GCRV感染的草鱼品种的辅助选择提供新的遗传标记。

本发明的技术方案如下：

申请人通过高通量测序的方法，鉴定得到草鱼C7N1基因在个体和细胞水平上存在相同的突变位点，其完整的cDNA序列如SEQ ID NO：1所述。经过序列比对发现，在该序列编码区的2145处存在单个碱基的替换突变,该突变未产生特殊的酶切多态性。但此突变造成了氨基酸的改变(对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述)，该突变可能影响草鱼C7N1基因的功能。通过设计的特异性引物扩增包含这一个突变碱基的片段后，测序证实了这个突变位点为：G或者A(其序列见SEQ ID NO：3，该序列是SEQ ID NO：1所述序列突变片段)。另外，转录组测序结果表明：草鱼C7N1基因的两种类型在抗性和易感草鱼群体和CIK细胞中存在表达差异(见表1)。申请人为了验证这一差异性，对感染后抗性和易感的草鱼经过基因分型和数据统计分析证实该位点突变确实与抗出血病性状存在显著相关性：抗性群体中基因型为杂合的个体数要多于易感群体。由此证明，将该位点作为草鱼出血病免疫性状预测和育种的遗传标记是切实可行的。

为了扩增包含该位点的片段，申请人设计了如下所示的特异性引物对：

正向引物：5’-GACTGAGAATGCTGTGAAAGATG-3’，

反向引物：5’-CAATGAGGTGGGATTTTAGTGA-3’。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

一种草鱼出血病免疫性状相关的遗传标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述，在该序列的2145处存在一个碱基的替换突变，即由碱基G转换为碱基A。

序列表SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，在所述序列的715处有1个氨基酸的替换突变。

申请人提供了一种检测所述遗传标记的引物对，该引物对的序列如下所示：

正向引物：5’-AAGGGCTGCGGATCGGAT-3’

反向引物：5’-CCTGCCTGACAGACATTTATTGC-3’。

申请人提供了一种筛选草鱼出血病免疫性状相关的遗传标记的方法，所述的方法包括下列步骤：

1)通过草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)感染实验将自然群体的草鱼分为抗性个体和易感个体，将草鱼CIK细胞通过流式细胞术单细胞分选结合GCRV感染试验分为抗性和易感两类；

2)提取草鱼的头肾、脾脏和单克隆CIK细胞的RNA，通过转录组测序筛选遗传标记；

3)利用混合池测序来验证转录组中C7N1基因的拼接结果，所述的C7N1基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；

4)利用PCR结合3.0％琼脂糖凝胶电泳的方法对C7N1基因进行分型；

5)利用在线分析软件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)进行性状关联分析。

本发明的草鱼出血病免疫性状相关的遗传标记可以在草鱼出血病免疫性状检测中应用。

本发明的引物对可以在草鱼出血病免疫性状检测中应用。

与现有技术相比本发明具有的有益效果：

本发明通过结合个体和细胞水平上的高通量测序结果筛选与草鱼出血病免疫性状相关的突变位点，结合这些位点再选取有差异表达的基因做单独试验验证而挖掘出与抗病性状相关的遗传标记位点，同时将草鱼基因与斑马鱼和稀有鮈鲫的同源基因比对后分析突变位点在不同物种的碱基类型。这种筛选和传统的单基因核苷酸多态位点筛选相比通量高、检测准确、速度快，得到的结果更可靠。本发明得到的SNP突变位点为今后的抗草鱼出血病育种奠定了理论基础。

更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明中C7N1基因完整的cDNA序列(1-2982)，在该序列的2145位碱基处存在一个SNP位点(2145位碱基处显示的碱基是突变后的碱基A)。

序列表SEQ ID NO：2是C7N1基因编码的氨基酸序列。序列长度为993aa(终止密码子TGA不翻译为氨基酸)。在该序列的715位存在1个氨基酸的替换(由Ile替换了Met)。

序列表SEQ ID NO：3是本发明中对这个SNP的C7N1基因突变进行基因分型设计引物所扩增出的目的片段(117bp)，所述的突变存在于该片段的第28位碱基处(即：G-A突变)。(第28位碱基处显示的碱基是突变后的碱基A)

序列表SEQ ID NO：4和5是检测本发明遗传标记的引物对的序列。如下所示：

正向引物：5’-AAGGGCTGCGGATCGGAT-3’

反向引物：5’-CCTGCCTGACAGACATTTATTGC-3’。

图1：本发明的总体技术流程示意图。

图2：草鱼CIK细胞抗性与易感的病变示意图。附图标记说明：C1为对照组，R2为抗性细胞，S3为易感细胞；A,B,C,D,E,F,G,H分别表示细胞的感染时间为0h,6h,12h,24h,48h,72h,96h,120h。

图3：转录组测序策略示意图。附图标记说明：采用双尾测序法分别对组织和细胞的RNA进行测序并拼接组装。

图4：DNA提取的琼脂糖电泳图。附图标记说明：图中1泳道：DNA分子量标准(Maker4)；2-6泳道：提取的组织DNA。

图5：PCR扩增包含突变位点片段的琼脂糖电泳图。附图标记说明：图中1泳道：DNA分子量标准(Maker 1)；2-9泳道：扩增的目的片段。

图6：用特异性引物扩增包含单个碱基突变片段酶切后不同基因型电泳图。附图标记说明：图中1泳道：M，DNA分子量标准(Maker 1)；2泳道：AB，杂合型个体；3泳道：AA，纯合型个体；4泳道：GG，纯合型个体。

图7：草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)感染后三种基因型比率统计的柱形图。附图标记说明：“*”代表差异显著。

图8：本发明中C7N1基因的cDNA序列。该序列的2145位碱基处的R为等位基因突变(A/G)(以下划线表示)。

图9：本发明中C7N1基因编码的氨基酸序列(终止密码子TGA不翻译氨基酸)。在该序列的715位存在1个氨基酸的替换，以I及下划线表示。

图10：本发明中对SNP的基因突变进行基因分型设计引物所扩增出的目的片段117bp，所示序列的28位碱基处的R为等位基因突变(A/G)以下划线表示。

具体实施方式

实施例1：草鱼脾脏、头肾和单克隆CIK细胞转录组测序

(1)感染试验

本实施例所用的水族箱用0.05％的高锰酸钾溶液浸泡24小时后清洗干净，并注入清水，安装好充氧泵、加热棒，将温度设置为28℃-30℃、开启充氧泵后准备暂养试验用草鱼。在草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)感染之前将草鱼随机分为五组(60尾/组)暂养于准备好的水族箱中，每天定点、定时、定量投喂两次适口颗粒饲料，并及时清理残饵和代谢废物。约一星期，待鱼群日常生理活动正常后准备病毒感染试验。GCRV-097毒株原液由中国科学院水生生物研究所惠赠。感染所用病毒悬液为本申请人的实验室感染试验后收集并保存于-80℃，经活化后的悬液。在病毒注射前，向病毒悬液中加入青霉素和链霉素各100IU/mL病毒悬液，防止注射期间的细菌感染。选取四组草鱼为感染组，另外一组为对照组。于感染组草鱼的腹腔和背鳍肌肉小心注射剂量为0.1mL/g体重的GCRV-097病毒悬液，对照组注射相同剂量的生理盐水。

草鱼CIK细胞系来自中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC，中国.武汉.武汉大学)，草鱼CIK细胞系的培养温度为28℃，CO₂浓度为5％，10％胎牛血清，培养基为DMEM(购自Gibico公司，美国)。通过流式细胞仪(BD FACSAriaTMIII Cell Sorter，美国)进行单细胞分选培养，GCRV感染，从而筛选出抗性CIK细胞与易感的CIK细胞。

(2)取样

GCRV-097病毒注射结束后，每3小时观察一次水族箱中鱼体的活动状况，及时收集24小时至48小时之间出现草鱼出血病症状的将死草鱼(即易感草鱼)并作好样品编号与记录。在冰上取下病鱼的脾脏、头肾放入1.5mL含有800μL冰Trizol试剂(购自宝生物大连有限公司)的无菌离心管中，小心研磨，待无明显块状组织后放入-80℃冰箱中保存；另一部分直接放入空的无菌1.5mL离心管中于-80℃冰箱中保存。感染试验7天之后存活的草鱼被认为是抗性个体，按以上的方法取脾脏、头肾样品保存。

根据单克隆CIK细胞对GCRV的反应筛选出抗性与易感细胞，分别收集对应的未感染细胞按以上方法进行保存。

(3)提取脾脏、头肾和单克隆CIK细胞总RNA

采用Trizol法提取总RNA(按照Trizol试剂说明书进行操作)。具体操作方法如下(所用微量移液器的枪头均已用DEPC水处理过)：

1)取草鱼脾脏、头肾样品和单克隆CIK细胞样品分别置于装有800μL Trizol试剂的1.5mL离心管(DEPC水处理过的)中；

2)充分研磨后，置冰保存备用(或置于-80℃长期保存备用)；

3)每管加160μL氯仿，盖紧上盖，剧烈振摇15s，室温放置3min；

4)4℃、12000rpm离心15min；

5)备1.5mL离心管(DEPC水处理过的)，将步骤4)中无色上层水相分别转至其中，加400μL异丙醇，轻缓混匀，室温放置10min；

6)4℃、12000rpm离心10min；

7)吸弃上清，加800μL 75％乙醇(DEPC水处理过的)，轻弹管壁漂洗5s；

8)4℃、7500rpm离心5min；

9)吸弃上清，风干10min；

10)加100μL ddH₂O(DEPC处理过的)，58℃水浴10min，立即放入-80℃保存。

(4)转录组测序

将提取好的脾脏、头肾和单克隆CIK细胞RNA用干冰分别寄送到上海美吉生物医药科技有限公司和广州基迪奥生物科技有限公司利用Illumila的Miseq和HiSeq2500平台测序并进行序列拼接、差异表达、聚类等基本分析。测序策略见图3。C7N1基因在脾脏、头肾和单克隆CIK细胞中的表达量见表1。

表1 C7N1在转录组的表达量(FPKM值)

(5)生物信息学分析

将测序得到的个体与细胞水平上的抗性与易感相关的SNP位点进行分析，发现只有一个突变位点同时存在于个体和细胞水平上，且与抗病性相关。再通过比对分析斑马鱼和稀有鮈鲫同源基因上该位点的碱基类型，结果见表2。

表2突变位点在草鱼、稀有鮈鲫和斑马鱼中的碱基类型

实施例2：C7N1基因验证及关联分析

(1)草鱼脾脏组织的DNA提取

采用常规氯仿法提取基因组DNA。具体操作方法如下：

1)取0.05g组织(绿豆大小)放1.5mL EP管中，加200μL组织提取液，充分研碎。再加400μL组织提取液和60μL的1mg/mL的蛋白酶K，放55℃水浴(约3h)或者37℃过夜，消化至液体澄清；

2)加600μL Tris-饱和酚，充分混合10min，12,000rpm离心10min；

3)转移上清液于新EP管，加500μL氯仿抽提，充分混合10min，12,000rpm离心10min；

4)移取上清于新EP管，加2倍体积的冰乙醇(-20℃)，于-20℃沉淀DNA至少30min，随后12,000rpm离心5min；

5)弃上清，用70％乙醇洗1-2次，室温下风干；

6)加50μL三蒸水溶解DNA，-20℃保存备用。提取DNA结束后，取2μL提取的DNA用1％琼脂糖凝胶(含0.01％的核酸染料Gelview)进行电泳检测。检测结果见图4。

(2)引物设计

针对单个碱基的替换，利用Primer Premier 5软件设计了一对引物，用于基因型检测，所述的引物由武汉擎科创新生物科技有限公司合成。所述的引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：5’-GACTGAGAATGCTGTGAAAGATG-3’

反向引物：5’-CAATGAGGTGGGATTTTAGTGA-3’。

(2)PCR扩增

将合成的引物用ddH₂O稀释至10μM浓度。PCR反应体系总体积为20μL：Mix10μL，正向引物0.6μL，反向引物0.6μL，cDNA 1μL，双蒸水7.8μL。扩增条件：94℃预变性1min、94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸30s、35个循环、72℃再延伸5min。取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5。

(3)PCR-电泳分型

将感染试验获得的26条易感草鱼和30条抗性草鱼，经过DNA提取和PCR扩增后用3.0％琼脂糖凝胶电泳检测分型。分型示例电泳图见图6。分型后使用在线分析软件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)(Shi YY和He L.2005.SHEsis,a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium,haplotype construction,and genetic association at polymorphism loci.Cell Res,15(2):97-8)分析，结果见表3。

表3草鱼C7N1基因分型统计结果

表3说明：表3中的AA基因型和BB基因型代表纯合子，AB基因型代表杂合子；“*”表示差异显著。

由表1可知，该C7N1基因转录本在抗性个体和细胞中的表达量低于易感个体和细胞。由表3和图7可知，AB基因型个体中的抗性个体数多于易感个体数；BB基因型个体中的抗性个体数少于易感个体数(P<0.05)。同样，A等位基因中抗性个体数多于易感个体数，B等位基因中抗性个体数少于易感个体数。因此可以得知，这个SNP位点对应所编码的氨基酸即“M/I”对C7N1功能的发挥起着重要作用。因此选择杂合型对草鱼出血病免疫性状选择是有利的。