本发明属于分子生物学和基因工程领域，涉及1个在植物逆境胁迫中发挥重要调控作用的基因agdreb2。本发明公开了一种利用聚合酶扩增技术从芹菜品种‘津南实芹’中克隆出抗逆相关dreb转录因子的方法。
背景技术：
芹菜(apiumgraveolensl.)是伞形科(apiaceae)一年或多年生草本植物，原产于地中海和中东地区，在我国栽培历史悠久，分布较广。芹菜含有丰富的营养成分和膳食纤维，除作为蔬菜外，还具有极好的药用功能。‘津南实芹’是天津津南区选育的优良地方品种，抗逆性强，生长速度快，我国南北四季均可栽培(李海燕，天津农林科技2004，4：21)。
农作物的生长、发育及产量受到许多生物和非生物胁迫的影响，如干旱、低温或高温等极端天气、土壤盐渍化等。在植物中，许多基因在胁迫下被诱导表达，这些基因不仅自身能产生有抵抗力的功能性蛋白，同时也作为信号传导因子参与胁迫应答(yamaguchi-shinozakiandshinozaki，annurevplantbiol2006，57：781-803；caoetal.，plantsignalbehav2008，3：761-763)。一些研究已经表明转录因子在基因表达调控中起重要作用，其中ap2/erf家族转录因子是一类广泛参与各种生物过程的转录因子，如花和种子的发育(chungetal.，plantj2010，64：936-947)，果实成熟、抵抗病原菌、参与胁迫应答等(guttersonandreuber，curropinplantbiol2004，7：465-471；chenetal.，plantmolbiolrep2012，30：1415-1425)。ap2/erf家族是植物中非常大的一类转录因子家族，该成员均含有一个60～70氨基酸组成的结构域。ap2/erf家族成员又可分为5大类：ap2、rav、dreb、erf和一个单独类别。其中，dreb又可分为6个六个亚组(a1、a2、a3、a4、a5和a6)，erf也分为6个六个亚组(b1、b2、b3、b4、b5和b6)。转录因子可以通过结合下游基因的启动子中的cis元件调节下游基因在不同时空、不同组织或不同条件的表达量(shinozakiandyamaguchi-shinozaki，curropinplantbiol2000，3：217-223；schrammetal.，plantj2008，53：264-274)。以往研究证明dreb类转录因子能够特异性地结合dre(dehyarationresponsiveelement)顺式元件，dre元件也在许多非生物胁迫相关的基因的启动子中被发现(stockingeretal.，procnatlacadsciusa1997，94：1035-1040；maruyamaetal.，plantj2004，38：982-993；maruyamaetal.，dnares2012，19：37-49)。
技术实现要素：
本发明提供了一种芹菜转录因子agdreb2基因的制备方法和用途。本发明利用聚合酶扩增技术从芹菜‘津南实芹’中克隆的dreb转录因子，所获得的dreb转录因子能够增强植物对逆境的耐性。
附图说明
图1.芹菜agdreb2蛋白序列与拟南芥ap2/erf家族的进化树分析。
图2.芹菜agdreb2基因在不同逆境胁迫下的表达分析。
图3.酵母单杂交验证agdreb2蛋白结合dre元件。
图4.β-半乳糖苷酶活性测定芹菜agdreb2蛋白结合能力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。具体实验步骤如下：
1.芹菜总rna的提取及cdna的合成
芹菜总rna提取按照rna试剂盒(rnasimplytotalrnakit，北京天跟公司)说明书进行，用primescriptrtreagentkit(大连takara公司)将提取的总rna反转录成cdna。
2.芹菜转录因子agdreb2基因的克隆
基于芹菜转录组测序信息，以拟南芥ap2/erf转录因子家族为信息探针，进行检索分析，获得芹菜agdreb2的基因序列。正向：5’-atggatcagttactcaccaatc-3’，反向5’-tcaaaatgaaaaactccataaagac-3’。以‘津南实芹’cdna为模板进行扩增，pcr反应条件为：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃60s，共30个循环；72℃10min。pcr产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳回收后，连接到pmd18-t载体上并转化大肠杆菌dh5α，提取质粒经pcr鉴定后委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
3.序列分析
通过核苷酸序列测定，获得了芹菜转录因子agdreb2基因的序列，对其编码的氨基酸序列进行分析。氨基酸组成与多序列比对采用clustalx软件，进化树分析使用mega4.0软件。
4.实时定量pcr反应
对生长两个月‘津南实芹’幼苗分别进行4种逆境胁迫处理：4℃低温处理、干旱处理(200g·l-1的peg6000)、盐胁迫处理(200mmol·l-1的nacl)、aba激素(0.1mmol·l-1)处理。分别于处理后0、1、3、6、12、24和48h取叶片样本并立即用液氮速冻后，保存于-80℃冰箱中。根据‘津南实芹’中扩增的agdreb2基因序列设计表达检测引物，正向为5’-ctcccaccgaaacaacaagcaaag-3’，反向为5’-cggaacaggcaacctccatacg-3’。荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr)是采用abi7300real-timepcrsystem和7300systemsoftware。实时定量pcr使用宝生物工程(大连)有限公司的sybrpremixextaq试剂盒，按照操作说明进行。采用芹菜的tub-b基因作为参考基因(lietal.，frontiersplantsci2016，7：313)，与目标基因一起扩增，引物序列为正向5’-tggtggcactggatctggtatgg-3’，反向为5’-actttcggaggagggaagactgaa-3’，目的基因相对转录表达水平的计算公式为2-ctδ，ctδ＝ct(目的基因)-ct(actin)。
5.酵母单杂交体系和x-gal活性的测定
酵母菌株为egy48，鱼饵质粒g222(g221质粒载体插入3拷贝的dre顺式元件后构建成)载体由本实验室保存构建(lietal.，molgenetgenomics2015，290：2049-2061)。将扩增好的agdreb2基因片段克隆在酵母系统ppc86载体(lietal.，molgenetgenomics2015，290：2049-2061)的bamhi-saci位点上。同时将重组质粒转化菌株egy48，均匀涂于sd/-trp/-his双缺陷平板，30℃培养箱培养2～3d后，将转化子影印到无菌硝酸纤维素膜上，平铺于含有x-gal的sd培养基上，1d后观察是否显蓝色。并以onpg(o-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside)(美国sigma公司)为底物，进行β-半乳糖苷酶活性检测。
6试验结果：
1).从芹菜品种‘津南实芹’中克隆出的编码芹菜dreb转录因子基因agdreb2。多序列比对和进化树分析显示该转录因子蛋白属于ap2/erf类转录因子家族中的dreb-a1亚家族(图1)。
2).荧光定量表达分析结果显示芹菜agdreb2基因对非生物胁迫有响应，证明该转录因子参与了芹菜植株对多种非生物胁迫调控(图2)。
3).酵母转录激活实验证明，芹菜agdreb2基因可以与dre顺式作用元件特异结合，并具有较高的转录激活活性，进一步证实芹菜agdreb2基因对非生物逆境具有调控作用(图3和图4)。