本发明属于制药领域，提供一类吉西他滨ProTide乏氧活化前药及其应用。
背景技术：
吉西他滨是临床常用的抗肿瘤药物，但是容易发生耐药，其ProTide前药NUC-1031能够减少耐药发生，具有良好的抗肿瘤作用，已经进入临床研究(Journal of Medicinal Chemistry2014，57，1531-1542)。但是NUC-1031不能减少药物对正常组织的毒副作用。
随着肿瘤的快速生长，部分肿瘤组织离最近的血管越来越远，氧供应不足，导致肿瘤乏氧(Nature review cancer 2002,2:38-47)。传统的抗癌药物对血管附近的肿瘤有良好的杀伤力，但对乏氧区域的肿瘤作用有限。肿瘤乏氧活化前药能够特异性地在肿瘤乏氧区域释放抗肿瘤活性成分，从而杀伤乏氧区域肿瘤(Chinese Journal of Cancer 2014,33:80-86)。乏氧活化前药具有良好的肿瘤靶向性，从而具有更好的安全性，与传统的抗癌药联合使用时抗瘤效果更加出色。其中TH302已经进入临床研究，对胰腺癌等具有良好的治疗作用(Journal of Clinical Oncology 2015，33，1475-1482)。
技术实现要素：
本发明的目的：本发明提供吉西他滨ProTide乏氧活化前药及其应用。该类前药能够利用肿瘤组织与正常组织微环境的不同，在肿瘤乏氧区域特异性的释放出抗肿瘤药物活性物质，发挥抗肿瘤作用，能够减少对其他组织的毒副作用，对肿瘤具有优异的抗癌作用和良好的安全性，可用于制备治疗肿瘤的药物。
技术方案：吉西他滨ProTide乏氧活化前药，其化学结构为：
其中：R1、R2中的一个为1-6个碳原子的烷基、苯基、苄基、1-萘基、-C(R3R4)-Ar-NO2的乏氧活化基团，另一个为-C(R3R4)-Ar-NO2的乏氧活化基团，所述-C(R3R4)-Ar-NO2的乏氧活化基团的化学结构为：
其中R3为H或甲基，R4为甲基。具体结构如下所示：
上述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用。
治疗肿瘤药物，有效成分为上述的吉西他滨ProTide乏氧活化前药或其药学上可接受的盐。
本发明的化合物或其药学上可接受的盐可制成各种制剂，包含但不限于片剂、胶囊、注射液、冻干粉等。
有益效果：本发明所述的吉西他滨ProTide乏氧活化前药能够利用肿瘤组织与正常组织微环境的不同，在肿瘤乏氧区域特异性的释放出抗肿瘤药物活性物质，发挥抗肿瘤作用，能够减少对其他组织的毒副作用，对肿瘤具有优异的抗癌作用和良好的安全性，可用于制备治疗肿瘤的药物。
附图说明
图1为目标化合物001对人BxPC-3裸小鼠原位移植瘤的生长抑制作用示意图。给药后，实验组(化合物001)裸鼠胰腺肿瘤组织质量明显低于吉西他滨组、NUC-1031组，提示其具有更好的抑制肿瘤生长作用。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员可全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中涉及到的目标化合物结构如下：
实施例1：3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨的合成
合成路线(参考文献方法获得，The Journal of Organic Chemistry，1999，64:8319-8322)：
实验操作：吉西他滨(gemcitabine，0.60g，2mmol)，Na2CO3(1.06g)，40mL二氧六环，40mL水，二碳酸二叔丁酯(DBDC，0.44g，2mmol)于室温搅拌48小时。加入20mL水，用2×300mL乙酸乙酯萃取，Na2SO4干燥，减压浓缩。快速柱层析(CH2Cl2-乙酸乙酯-EtOH 1:1:0.02)得到3′-O-(N-叔丁氧羰基)吉西他滨(0.60g)。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):7.64(d,1H)7.40(d,2H)6.21(t,1H)5.81(d,1H)5.25-5.12(m,2H),4.13(t,1H)3.71-3.60(m,2H)1,45(s,9H).
实施例2：化合物001的合成
合成路线(参考文献方法获得，The Journal of Medicinal Chemistry，2014，57:1531-1542)：
在100mL茄形瓶中加入10mL重蒸二氯甲烷，加入三氯氧磷(0.2g，1.3mmol)于二氯甲烷内，将反应体系放置于-78℃的环境下，向其中加入三乙胺(0.13g，1.3mmol)，搅拌15min后，滴加苯酚(0.153g，1mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液，15min滴毕，-78℃反应1h，室温反应1h。将整个反应体系继续放置于-78℃环境下，向其中加入0.23g(2.3mmol)的三乙胺，搅拌15min后，加入溶有0.275g(1mmol)L-丙氨酸1-(4-硝基苯基)乙醇酯盐酸盐的重蒸二氯甲烷液10mL，搅拌3h。另取一50mL茄形瓶，加入30mL重蒸二氯甲烷，加入0.29g(0.8mmol)3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨，加入0.2g(2mmol)三乙胺，再加入N-甲基咪唑2mL，室温下，将此二氯甲烷液加入上瓶100mL反应体系中，室温反应过夜。浓缩溶剂，滤去不溶物，滤液用3×30mL水洗涤，以二氯甲烷萃取，浓缩溶剂，用三氟乙酸和二氯甲烷(体积比1:1)(6mL)于0℃搅拌4小时，浓缩溶剂，快速柱层析(二氯甲烷：甲醇体积比20:1)。得化合物001：1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.19(dd,2H),7.75-7.70(m,1H),7.63(dd,2H),7.41-7.36(m，2H)，7.29-7.22(m,3H)，6.25-6.23(m,1H),6.10-6.04(m,1H),5.30-5.20(m,1H),4.89-4.81(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.89-3.60(m,2H),1.56-1.50(m,3H),1.30-1.20(m,3H).
按照同样的方法，合成了化合物002-化合物012。
化合物002：参考化合物001方法，采用苯酚，L-丙氨酸1-(4-硝基苯基)-1-甲基乙醇酯盐酸盐，3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨合成。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.18(dd,2H),7.76-7.70(m,1H),7.64(dd,2H),7.41-7.36(m，2H)，7.29-7.23(m,3H)，6.25-6.21(m,1H),6.10-6.05(m,1H),4.89-4.80(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.89-3.61(m,2H),1.56-1.51(m,3H),1.28-1.19(m,6H).
化合物003：参考化合物001方法，采用苯酚，L-丙氨酸1-(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基)-乙醇酯盐酸盐，3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨合成。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.19(dd,2H),7.75-7.71(m,1H),7.63(dd,2H),7.22(s,1H)，6.26-6.23(m,1H),6.11-6.04(m,1H),5.05-5.00(m,1H),4.89-4.81(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.87-3.60(m,2H),1.53-1.47(m,3H),1.30-1.20(m,3H).
化合物004：参考化合物001方法，采用苯酚，L-丙氨酸1-1-(5-硝基-呋喃-2-基)-乙醇酯盐酸盐，3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨合成。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.20(dd,2H),7.75-7.65(m,2H),7.63(dd,2H),6.25-6.23(m,1H),6.12-6.02(m,2H),4.89-4.81(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.89-3.60(m,2H),1.53-1.46(m,3H),1.31-1.20(m,3H).
化合物005：参考化合物001方法，采用苯酚，L-丙氨酸1-1-(5-硝基-噻吩-2-基)-乙醇酯盐酸盐，3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨合成。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.19(dd,2H),7.84-7.72(m,2H),7.62(dd,2H),6.25-6.22(m,1H),6.08-5.96(m,2H),4.89-4.80(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.89-3.61(m,2H),1.53-1.47(m,3H),1.30-1.21(m,3H).
化合物006：参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸苄酯盐酸盐，3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨合成。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.19(dd,2H),7.75-7.70(m,1H),7.63(dd,2H),7.36-7.30(m,5H),6.25-6.23(m,1H),6.11-6.05(m,1H),5.25-5.15(m,1H),4.89-4.81(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.89-3.60(m,2H),1.56-1.51(m,3H),1.28-1.20(m,6H).
化合物007：参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸甲酯盐酸盐，3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨合成。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.19(dd,2H),7.75-7.70(m,1H),7.63(dd,2H),6.25-6.23(m,1H),6.10-6.04(m,1H),5.25-5.15(m,1H),4.89-4.81(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.89-3.60(m,2H),3.58(s,3H),1.57-1.50(m,3H),1.29-1.23(m,3H).
化合物008：参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸乙酯盐酸盐，3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨合成。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.19(dd,2H),7.75-7.70(m,1H),7.63(dd,2H),6.25-6.21(m,1H),6.10-6.04(m,1H),5.27-5.15(m,1H),4.89-4.81(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.89-3.60(m,4H),1.56-1.50(m,3H),1.28-1.20(m,3H).
化合物009：参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸异丙酯盐酸盐，3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨合成。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.19(dd,2H),7.75-7.70(m,1H),7.63(dd,2H),6.25-6.23(m,1H),6.10-6.04(m,1H),5.25-5.13(m,1H),4.89-4.81(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.89-3.60(m,3H),1.56-1.51(m,3H),1.29-1.23(m,3H),1.20-1.00(m,6H).
化合物010：参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸丁酯盐酸盐，3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨合成。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.19(dd,2H),7.75-7.70(m,1H),7.63(dd,2H),6.25-6.23(m,1H),6.10-6.04(m,1H),5.26-5.15(m,1H),4.89-4.81(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.89-3.60(m,4H),1.56-1.50(m,3H),1.51-1.47(m,2H),1.30-1.20(m,5H),0.85-0.81(m,3H).
化合物011：参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸2，2-二甲基丙酯盐酸盐，3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨合成。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.19(dd,2H),7.75-7.70(m,1H),7.63(dd,2H),6.25-6.23(m,1H),6.10-6.04(m,1H),5.25-5.15(m,1H),4.89-4.81(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.89-3.60(m,4H),1.56-1.50(m,3H),1.29-1.23(m,3H),0.82(s,9H).
化合物012：参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸环己酯盐酸盐，3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨合成。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.19(dd,2H),7.75-7.70(m,1H),7.63(dd,2H),6.25-6.23(m,1H),6.10-6.04(m,1H),5.25-5.14(m,1H),4.89-4.81(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.89-3.60(m,4H),1.67-1.59(m,4H),1.56-1.50(m,3H),1.41-1.18(m,9H).
化合物013：参考化合物001方法，采用1-萘酚，L-丙氨酸1-(4-硝基苯基)乙醇酯盐酸盐，3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨合成。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.19(dd,2H),8.14-8.12(m，1H)，7.96-7.94(m,1H)，7.75-7.70(m,1H),7.63(dd,2H),7.59-7.45(m,5H)，6.25-6.23(m,1H),6.10-6.04(m,1H),5.30-5.20(m,1H),4.89-4.80(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.89-3.60(m,2H),1.56-1.50(m,3H),1.30-1.20(m,3H).
化合物014：参考化合物001方法，采用1-萘酚，L-丙氨酸1-(4-硝基苯基)-1-甲基乙醇酯盐酸盐，3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨合成。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.20(dd,2H),8.14-8.12(m，1H)，7.96-7.94(m,1H)，7.75-7.70(m,1H),7.63(dd,2H),7.59-7.45(m,5H)，6.25-6.23(m,1H),6.10-6.04(m,1H),4.89-4.79(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.89-3.60(m,2H),1.56-1.50(m,3H),1.28-1.20(m,6H).
化合物015：参考化合物001方法，采用1-(4-硝基苯基)乙醇，L-丙氨酸1-(4-硝基苯基)乙醇酯盐酸盐，3′-O-(叔丁氧羰基)吉西他滨合成。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.28-8.14(m,4H),7.81-7.70(m,2H),7.72-7.58(m,4H),6.25-6.23(m,1H),6.10-6.04(m,1H),5.30-5.15(m,2H),4.89-4.80(m,2H),4.20-4.10(m,1H),3.89-3.60(m,2H),1.56-1.49(m,3H),1.30-1.19(m,3H).
实施例3：目标化合物正常氧状态、乏氧状态下对肿瘤细胞增殖体外抑制作用研究
取对数生长期肿瘤细胞，加入0.25％胰酶消化3min，用含10％小牛血清RPMI-1640悬浮细胞，计数，调细胞浓度为1×105个/mL，以100μL/孔接种于Top-count专用96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2孵育24h。然后将细胞分为实验组和对照组，实验组加入目标化合物溶液(0.001μg/mL，0.01μg/mL，0.1μg/mL，1μg/mL，10μg/mL)，每一浓度均为四复孔，且每孔体积均补足200μL。各组加样后分别继续培养72h(乏氧组于5％CO2，95％N2下分别继续培养72h)，于培养结束前，每孔分别加入3H-TdR 3×105Bq，用Top-count测定各孔CPM(count per minute)值。计算细胞存活率(cell survival rate，CSR)，各实验组药物对细胞增殖的半数抑制浓度(median inhibition concentration，IC50)。
表1目标化合物正常氧、乏氧状态下对肿瘤细胞增殖(72小时)的半数抑制浓度(IC50，μg/mL)
采用吉西他滨、NUC-1031、实施例化合物1的结构类似物16【实施例化合物的-C(R3R4)-Ar-NO2的乏氧活化基团中，R3、R4为均H】为对照，测定了目标化合物在正常氧、乏氧状态下的对肿瘤细胞增殖体外抑制作用。以上实验结果显示：本发明的实施例化合物(1-15)在正常氧、乏氧状态下的对肿瘤细胞增殖体外抑制作用具有显著差异(10-50倍)，吉西他滨、NUC-1031、化合物16，在正常氧、乏氧状态下的对肿瘤细胞增殖体外抑制作用没有显著差异。提示本发明的实施例化合物对乏氧区域的肿瘤有更强的细胞毒性。
实施例4：目标化合物对人BxPC-3裸小鼠原位移植瘤的生长抑制作用
取对数生长期的BxPC-3人类胰腺癌细胞，以5×106个细胞·0.2mL-1·只-1的浓度，接种于裸鼠背部皮下，建立人原发性胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，待生长成1cm皮下移植瘤后取出，无菌条件下去除中央坏死组织，选取周围健康肿瘤组织剪成1mm3的组织块。
外科原位移植模型制备:戊巴比妥钠(50mg/Kg)腹腔麻醉裸鼠，左上腹直肌旁切口，暴露脾脏和胰尾，剪开胰腺被膜，将瘤块植入胰尾近脾动脉处，缝合胰腺被膜。
给药方案:术后3周后模型动物随机被分为实验组(化合物001)、对照组、吉西他滨组、NUC-1031组，于术后第3周起分别经腹腔注射给药(0.2mmol/kg,2次/每周)，持续4周，停药一周后处死裸鼠，取胰腺肿瘤组织，称重。抑制效果见图1：目标化合物对人BxPC-3裸小鼠原位移植瘤的生长抑制作用。给药后，实验组(化合物001)裸鼠胰腺肿瘤组织质量明显低于吉西他滨组、NUC-1031组，提示其具有更好的抑制肿瘤生长作用。
以上实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。