疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的培养基及方法与流程

本发明涉及植物组培快繁技术领域，尤其是涉及一种疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的培养基及方法。

背景技术：

野生稻是水稻育种的宝贵种质。国内外育种研究表明，具AA型染色体组的野生稻在水稻育种中起过巨大的作用。育种家们公认，要获得突破性良种，必须寻找新的亲源。可见利用野生稻作亲本势在必行。但因栽培稻是具AA型染色体组的稻种和普通野生稻杂交容易成功，而和非AA型染色体组的稻种杂交，用一般常规有性杂交方法往往导致失败。而在野生稻中非AA型染色体组的野生稻，才往往具有栽培和普遍野生稻所罕有的优异性状。

疣粒野生稻是我国现存的三种野生稻之一，经鉴定它对白叶枯的抗性达到高抗接近免疫，抗性持久，是最理想的抗病育种材料。为了充分利用疣粒野生稻亲源，严成其等科研工作者从事了多年相关研究(参见：疣粒野生稻与栽培稻体细胞杂交创造新种质的研究[J].《宁波农业科技》，2002，NO.4：24。Yan CQ,Yan QS,et al.Use of asymmetric somatic hybridization for transfer of the bacterial blight resistance trait from.sativa L.ssp.japonica[J].《Plant Cell Reports》，2004，22(8):569-575.)，并成功建立了在栽培稻原生质体再生植株的技术基础上，进行疣粒野生稻与栽培稻原生质体的融合，获得体细胞种间杂种再生植株，实现疣粒野生稻的遗传物质向栽培稻转移。

目前，通过组织培养这一技术手段是解决疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的有效措施，但所使用的培养基往往添加了大量的化学合成植物激素以促进植物快速繁殖与生长，基于这种培养基在培养疣粒野生稻体细胞杂交后代繁殖过程中往往也存在组培苗抗逆性差及成苗率低下等缺陷。

因此，有必要提供一种新型的培养基，并在该培养基的基础上对疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖方法产生改进，以克服上述缺陷。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术中因培养基成分而造成疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖过程中存在组培苗抗逆性差及成苗率低下的技术问题，本发明提供一种改进的疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的培养基及方法，以达到疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖过程中组培苗健康生长及成苗率高的目的。

本发明提供一种疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的培养基，所述疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的培养基由诱导培养基、分化培养基及生根培养基组成；

所述诱导培养基的配方为：MS+2,4-D 1.5-2.2mg/l+6-BA 0.1-0.3mg/l；

所述分化培养基的配方为：MS+NAA 1.5-2.5mg/l+6-BA 0.1-0.3mg/l+KT 0.5-3mg/l；

所述生根培养基的配方为：1/2MS+NAA 0.01-0.3mg/l。

在本发明提供的所述疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的培养基一较佳实施例中，所述诱导培养基的配方为：MS+2,4-D 1.8mg/l+6-BA 0.2mg/l，所述分化培养基的配方为：MS+NAA 1.8mg/l+6-BA 0.2mg/l+KT 1mg/l，所述生根培养基的配方为：1/2MS+NAA0.02mg/l。

在本发明提供的所述疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的培养基一较佳实施例中，所述诱导培养基、分化培养基及生根培养基的pH值均为5.5-5.9。

本发明还提供一种疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的方法，包括如下步骤：

诱导培养：将疣粒野生稻体细胞杂交后代的种子进行预处理后接种于上述诱导培养基上进行诱导培养，诱导出胚性细胞；

分化培养：将胚性细胞接种于上述分化培养基上进行分化培养，分化出小苗；

生根培养：将小苗接种于上述生根培养基上进行生根培养，长出根系成为完整试管苗。

在本发明提供的所述疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的方法一较佳实施例中，所述预处理为：将疣粒野生稻体细胞杂交后代的种子经70％酒精消毒30秒、0.1％升汞加一滴、摇动消毒8分钟及无菌水洗3-5次后，作为外植体备用。

在本发明提供的所述疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的方法一较佳实施例中，所述诱导培养的培养条件为：温度25±2℃，光强1000lux、光照16小时/天，至四周后增强到2000lux，六周后增强到4000lux，培养1.5-2个月至诱导出胚性细胞。

在本发明提供的所述疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的方法一较佳实施例中，所述分化培养的培养条件为：温度25±2℃，光强2000-3000lux、光照16小时/天，1个月至长成8-10cm长小苗。

在本发明提供的所述疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的方法一较佳实施例中，所述生根培养的培养条件为：温度25±2℃，光强2000-3000lux、光照16小时/天，1周后长出根系成为完整试管苗。

相较于现有技术，本发明提供的所述疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的培养基及方法具有以下有益效果：

一、诱导培养基使得诱导的愈伤组织细胞质地硬及胚性化明显；分化培养基使得从胚性细胞分化绿色芽点频率高，从100个胚性细胞有63％产生绿芽；生根培养基使得所有接种的绿芽100％生根并获得绿苗。

二、疣粒野生稻的体细胞杂交后代直接分生出大量的不定丛生芽，高频率再生植株，既方便又高效，节约成本。

三、在短期内快速大量繁殖疣粒野生稻的体细胞杂交后代试管苗，增殖速度快，生产周期短，繁殖系数高，可实现规模化生产。

四、快速大量繁殖得到的组织培养试管苗，遗传性一致，克服了常规种子繁殖后代易变异的缺点；此外，采用外植体材料少，可有效挽救珍稀濒危植物，有利于保护野生资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1为本发明提供的疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的培养基及方法所培养的疣粒野生稻体细胞杂交后代的组培苗。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明采用的材料之一疣粒野生稻体细胞杂交后代种子Y72，保存于浙江省农业科学院病毒与生物技术研究所。疣粒野生稻体细胞杂交后代是疣粒野生稻和栽培稻大粒香经不对称体细胞杂交产生的后代，它对水稻白叶枯病表现为高抗。

本发明提供一种疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的培养基，所述疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的培养基由诱导培养基、分化培养基及生根培养基组成；

所述诱导培养基的配方为：MS+2,4-D1.5-2.2mg/l+6-BA 0.1-0.3mg/l；

所述分化培养基的配方为：MS+NAA 1.5-2.5mg/l+6-BA 0.1-0.3mg/l+KT 0.5-3mg/l；

所述生根培养基的配方为：1/2MS+NAA 0.01-0.3mg/l。

所述诱导培养基、分化培养基及生根培养基的PH值均为5.5-5.9。

所述MS为基本培养基；所述2,4-D为2，4-二氯苯氧乙酸，生长素，在组培中能促进细胞的分裂和生长；所述6-BA为6苄基腺嘌呤，细胞分裂素，能促进细胞分裂；所述NAA为萘乙酸，是植物生长调节剂中的生长素类似物，可用于植物组织培养；所述KT为激动素，主要用于组织培养，促进细胞分裂和调节细胞分化。

本发明还提供一种基于所述疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的培养基的方法，包括如下步骤：

诱导培养：将疣粒野生稻体细胞杂交后代的种子进行预处理后接种于所述诱导培养基上进行诱导培养，诱导出胚性细胞；

分化培养：将胚性细胞接种于所述分化培养基上进行分化培养，分化出小苗；

生根培养：将小苗接种于所述生根培养基上进行生根培养，长出根系成为完整试管苗。

实施例1：

1)疣粒野生稻体细胞杂交后代种子预处理：将疣粒野生稻体细胞杂交后代种子经70％酒精消毒30秒、0.1％升汞加一滴、摇动消毒8分钟及无菌水洗3-5次后，作为外植体备用；

2)诱导培养：将种子接种在诱导培养基上，所述诱导培养基的配方为MS+2,4-D 1.8mg/l+6-BA 0.2mg/l；培养条件为在25±2℃，光强1000lux、光照16小时/天，至四周后增强到2000lux，六周后增强到4000lux，培养1.5-2个月至诱导出胚性细胞；

3)分化培养：将胚性细胞接种在分化培养基上，所述分化培养基的配方为MS+NAA 1.8mg/l+6-BA 0.2mg/l+KT 1mg/l；培养条件为在25±2℃，光强2000-3000lux、光照16小时/天，1个月至长成8-10cm长小苗；

4)生根培养：将小苗接种到生根培养基上，所述生根培养基1/2MS+NAA 0.02mg/l；培养条件为在25±2℃，光强2000-3000lux、光照16小时/天，1周后长出根系成为完整试管苗。之后进行植株移栽：4-6cm高的再生完整的植株移植于水稻土中。上述各阶段培养基的PH值均为5.5。组培苗生长效果参见图1。

实施例2：

1)疣粒野生稻体细胞杂交后代种子预处理：将疣粒野生稻体细胞杂交后代种子经70％酒精消毒30秒、0.1％升汞加一滴、摇动消毒8分钟及无菌水洗3-5次后，作为外植体备用；

2)诱导培养：将种子接种在诱导培养基上，所述诱导培养基的配方为MS+2,4-D 1.5mg/l+6-BA 0.1mg/l；培养条件为在25±2℃，光强1000lux、光照16小时/天，至四周后增强到2000lux，六周后增强到4000lux，培养1.5-2个月至诱导出胚性细胞；

3)分化培养：将胚性细胞接种在分化培养基上，所述分化培养基的配方为MS+NAA 1.5mg/l+6-BA 0.1mg/l+KT 0.5mg/l；培养条件为在25±2℃，光强2000-3000lux、光照16小时/天，1个月至长成8-10cm长小苗；

4)生根培养：将小苗接种到生根培养基上，所述生根培养基1/2MS+NAA 0.01mg/l；培养条件为在25±2℃，光强2000-3000lux、光照16小时/天，1周后长出根系成为完整试管苗。之后进行植株移栽：4-6cm高的再生完整的植株移植于水稻土中。上述各阶段培养基的pH值均为5.5。

实施例3：

1)疣粒野生稻体细胞杂交后代种子预处理：将疣粒野生稻体细胞杂交后代种子经70％酒精消毒30秒、0.1％升汞加一滴、摇动消毒8分钟及无菌水洗3-5次后，作为外植体备用；

2)诱导培养：将种子接种在诱导培养基上，所述诱导培养基的配方为MS+2,4-D 2.2mg/l+6-BA 0.3mg/l；培养条件为在25±2℃，光强1000lux、光照16小时/天，至四周后增强到2000lux，六周后增强到4000lux，培养1.5-2个月至诱导出胚性细胞；

3)分化培养：将胚性细胞接种在分化培养基上，所述分化培养基的配方为MS+NAA 2.5mg/l+6-BA 0.3mg/l+KT 3mg/l；培养条件为在25±2℃，光强2000-3000lux、光照16小时/天，1个月至长成8-10cm长小苗；

4)生根培养：将小苗接种到生根培养基上，所述生根培养基1/2MS+NAA 0.3mg/l；培养条件为在25±2℃，光强2000-3000lux、光照16小时/天，1周后长出根系成为完整试管苗。之后进行植株移栽：4-6cm高的再生完整的植株移植于水稻土中。上述各阶段培养基的PH值均为5.9。

本发明提供的所述疣粒野生稻体细胞杂交后代快速繁殖的培养基及方法具有以下有益效果：

一、诱导培养基使得诱导的愈伤组织细胞质地硬及胚性化明显；分化培养基使得从胚性细胞分化绿色芽点频率高，从100个胚性细胞有63％产生绿芽；生根培养基使得所有接种的绿芽100％生根并获得绿苗。

二、疣粒野生稻的体细胞杂交后代直接分生出大量的不定丛生芽，高频率再生植株，既方便又高效，节约成本。

三、在短期内快速大量繁殖疣粒野生稻的体细胞杂交后代试管苗，增殖速度快，生产周期短，繁殖系数高，可实现规模化生产。

四、快速大量繁殖得到的组织培养试管苗，遗传性一致，克服了常规种子繁殖后代易变异的缺点；此外，采用外植体材料少，可有效挽救珍稀濒危植物，有利于保护野生资源。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。