本发明涉及一种绿茶特征香香料的制备方法，尤其是一种采用大孔吸附树脂法加聚酰胺层析法制备绿茶香料的方法，属于植物提取技术领域。
背景技术：
绿茶，又称不发酵茶。绿茶是未经发酵制成的茶，因此较多的保留了鲜叶的天然物质，含有的茶多酚、儿茶素、叶绿素、咖啡碱、氨基酸、维生素等营养成分也较多。绿茶中的这些天然营养成份，对防衰老、防癌、抗癌、杀菌、消炎等具有特殊效果，是其他茶类所不及的。同时，由于绿茶含有大量的醇类、醛类、酮类、羧酸类、酯类等物质成分，天然赋予了绿茶丰富的特殊香气。
大孔吸附树脂是一类不含离子交换基团的交联聚合物，理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶媒，对有机物有浓缩、分离作用，且不受无机盐类、强离子及低分子化合物的干扰。大孔吸附树脂通过物理吸附能够选择地吸附有机物质，从而能够达到分离纯化的目的。根据树脂表面性质，大孔吸附树脂可分为非极性、中极性和极性三类。
聚酰胺是一类结构中含有重复单位酰胺键（-CO-NH-）的高分子聚合物，酰胺基团上的O、N原子在酸性介质中结合质子而带正电荷，以静电引力形成吸附溶液中的阴离子，故可与酚类、酸类、醌类、黄酮类等含酚羟基的化合物形成氢键而被吸附，与不能形成氢键的化合物分离。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种绿茶特征香香料的制备方法，该制备方法高效、简便，适用于大规模工业生产。
按照本发明提供的技术方案，所述绿茶特征香香料的制备方法，包括以下步骤：取绿茶用有机溶剂提取，合并提取液并减压浓缩，得到的浓缩物过大孔吸附树脂柱，先用去离子水冲洗再用极性有机溶剂洗脱，洗脱液进行减压浓缩，得到的浓缩物过聚酰胺层析柱，先用去离子水冲洗再用极性有机溶剂洗脱，洗脱液进行减压浓缩，得到的浓缩物即为绿茶特征香香料。
具体地，本发明涉及一种绿茶特征香香料的制备方法，包括以下步骤：
A、有机溶剂提取：将绿茶在40~60℃与搅拌的条件下用醇或酮有机溶剂水溶液提取2.0~4.0小时，重复提取2~3次，合并提取液，将提取液减压浓缩至无液体流出为止，得到浓缩物I；所述绿茶与醇或酮有机溶剂水溶液的重量比为1:6~12，醇或酮有机溶剂水溶液的体积百分数为60~95%；
在本发明中，醇或酮有机溶剂应该理解是一种能够从绿茶中提取特征香香料的有机溶剂，这些有机溶剂是一种易挥发的，其残留物还不会对产品产生不良后果的有机溶剂；
在本发明中，所述有机溶剂的浓度是以体积计60~95%，如果该浓度小于60%，则会产生大量多糖、蛋白质等水溶性杂质，后续纯化处理带来困难；如果该浓度大于95%，则会损耗过多有机溶剂，增加生产成本；因此，所述有机溶剂的浓度为60~95%是恰当的，优选地是65~90%，更优选地是75~80%；
所述的有机溶剂与醇或酮有机溶剂水溶液的重量比是1:6~12，如果超过这个重量比范围，则会溶解过多杂质，且会增加溶剂损耗；
B、大孔吸附树脂吸附：将浓缩物I在室温下通过大孔吸附树脂柱，流速为0.5~1.5倍柱体积/h；然后用去离子水淋洗至洗出液无色；再用醇洗脱剂对大孔吸附树脂柱进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液进行减压浓缩至无液体流出为止，得到浓缩物II；所述醇洗脱剂与大孔吸附树脂柱的体积比为2~5，醇洗脱剂进行洗脱时的流速为1~2倍柱体积/h；
在本发明中，大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以有选择地通过物理吸附水溶液中的有机物。它已广泛用于中草药有效成分的分离和提纯过程。它是以苯乙烯和丙烯酸酯为单体，以二乙烯苯为交联剂，以甲苯、二甲苯为致孔剂，它们相互交联聚合形成了多孔骨架结构。这种树脂通过它本身与被吸附的分子之间的范德华力和氢键作用而具有吸附性，因其网状结构和高比表面积而具有选择地吸附有机物质的能力，因此使用这种树脂能够实现分离与纯化的目的；
C、聚酰胺富集：将浓缩物II在室温下通过聚酰胺层析柱，流速为0.5~1.5倍柱体积/h；然后用去离子水淋洗至洗出液无色；再用醇洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，醇洗脱剂与聚酰胺层析柱的体积比为2~5，洗脱时的流速为1~2倍柱体积/h；接着将洗脱液进行减压浓缩至无液体流出为止，得到绿茶香料；
在本发明中，聚酰胺是一类结构中含有重复单位酰胺键（-CO-NH-）的高分子聚合物，酰胺基团上的O、N原子在酸性介质中结合质子而带正电荷，以静电引力形成吸附溶液中的阴离子，故可与酚类、酸类、醌类、黄酮类等含酚羟基的化合物形成氢键而被吸附，与不能形成氢键的化合物分离。
进一步的，所述步骤A中，在减压浓缩得到浓缩物I的同时回收醇或酮有机溶剂；所述步骤B中，洗脱液进行减压浓缩的同时回收醇；所述步骤C中，洗脱液进行减压浓缩的同时回收醇。所述的有机溶剂在提取步骤完成后需要进行回收，通常采用本技术领域的技术人员熟知的蒸馏法进行回收。
进一步的，所述的醇或酮有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮。
进一步的，所述大孔吸附树脂柱采用的树脂为D101、HPD20或AB-8大孔吸附树脂、或其极性与所述D101、HPD20、AB-8大孔吸附树脂相当的其它大孔吸附树脂。它们都是目前市场上广泛销售的产品，例如由天津浩聚树脂科技有限公司生产的D101型大孔吸附树脂、由日本三菱化学生产的HP20型大孔吸附树脂、由安徽三星树脂科技有限公司生产的AB-8型大孔吸附树脂、由西安蓝晓科技有限公司生产的LX-11、D101C型其它大孔吸附树脂。
进一步的，所述步骤C中聚酰胺层析柱采用的聚酰胺的规格为30-60目、60-100目或100-120目。它们都是目前市场上广泛销售的产品，例如由上海摩速科学器材有限公司生产的。
进一步的，所述步骤B中，醇洗脱剂采用体积百分数为15~90%的乙醇或甲醇水溶液。如果所述醇洗脱剂的浓度小于15%时，则洗脱剂极性较大，目标物难以洗脱，如果所述醇洗脱剂的浓度大于90%时，则溶剂损耗较大，增加生产成本，因此，所述醇洗脱剂的浓度为15~90 %是合理的，优选地是25~75%，更优选地是50~65%。
进一步的，所述步骤C中，醇洗脱剂采用体积百分数为15~90%的乙醇或甲醇水溶液。如果所述醇洗脱剂的浓度小于15%时，则洗脱剂极性较大，目标物难以洗脱，如果所述醇洗脱剂的浓度大于90%时，则溶剂损耗较大，增加生产成本，因此，所述醇洗脱剂的浓度为15~90 %是合理的，优选地是55~85%，更优选地是65~80%。
进一步的，所述步骤A、B、C中，减压浓缩的压力条件为0.01~0.08MPa。减压浓缩时使用的设备是目前中药加工技术领域里通常使用的设备，例如旋转蒸发器、真空减压浓缩器。
本发明制备的绿茶特征香香料茶香风味浓郁，且无明显苦涩味。
由于选用大孔吸附树脂和聚酰胺，其对香味物质的吸附选择性良好，吸附快，解吸也快，吸附容量较大；物理化学稳定性高，机械强度好，再生容易；操作十分简便，步骤少，成本低廉，溶剂皆可回收利用，也适用于大规模工业生产。
具体实施方式
本发明使用的大孔吸附树脂在使用前需要进行如下预处理：
95%乙醇浸泡24h，用95%乙醇洗至流出液与水1：5不浑浊，用水洗至无醇味；再用5%HCl通过树脂柱，浸泡2~4h，水洗至中性；再用2%NaOH通过树脂柱，浸泡2~4h，水洗至中性，备用。
然后，让步骤A得到的浓缩液在流速0.5~1.5倍柱体积/h与室温的条件下通过大孔吸附树脂柱，达到完全吸附。
所述的大孔吸附树脂柱在吸附后先用去离子水淋洗至洗出液无色，这样可以更加充分、彻底地将大孔吸附树脂柱吸附的糖类、粘液汁等水溶性大极性杂质清洗除去，然后，再用醇洗脱剂洗脱。
本发明使用的大孔吸附树脂在使用前需要进行如下预处理：
95%乙醇浸泡24h，用95%乙醇洗至流出液透明并在蒸干后无残渣（或极少残渣），用水洗至无醇味；再用2-2.5倍体积5%NaOH水溶液、1倍体积的蒸馏水、2-2.5倍体积10%醋酸水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至中性，备用。
然后，让步骤B得到的浓缩液在流速0.5~1.5倍柱体积/h与室温的条件下通过聚酰胺层析柱，达到完全吸附。
所述的聚酰胺层析柱在吸附后先用去离子水淋洗至洗出液无色，这样可以更加充分、彻底地将聚酰胺层析柱吸附的极少量极性大的杂质清洗除去，然后，再用醇洗脱剂洗脱。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：绿茶特征香香料的制备方法，实施步骤如下：
A、有机溶剂提取：
将绿茶与醇或酮水溶液的重量比1:10，所述的绿茶在温度53℃与搅拌的条件下用浓度以体积计65%乙醇水溶液提取3小时，再以同样方式重复提取2次，提取液合并，接着使用由上海亚荣生化仪器厂生产的旋转蒸发器在压力0.08MPa的条件下进行减压浓缩，至无液体流出为止，得到浓缩物I，同时回收有机溶剂；
B、大孔吸附树脂吸附：
让步骤A得到的浓缩物I在流速1.0倍柱体积/h与室温的条件下通过由天津浩聚树脂科技有限公司生产的D101型大孔吸附树脂柱，然后用去离子水淋洗至洗出液无色，再按照醇洗脱剂与大孔吸附树脂柱的体积比为4，以流量为1.5倍柱体积/h用浓度为以体积计85%乙醇水溶液洗脱剂行洗脱，收集洗脱液，接着使用由上海亚荣生化仪器厂生产的旋转蒸发器在压力0.08MPa的条件下减压浓缩，至无液体流出为止，得到浓缩物II，同时回收醇；
C、聚酰胺富集：
让步骤B得到的浓缩物II在流速1.2倍柱体积/h与室温的条件下通过由上海摩速科学器材有限公司生产的聚酰胺（型号是30-60）层析柱，然后用去离子水淋洗至洗出液无色，再按照醇洗脱剂与聚酰胺层析柱的体积比为3，以流量为1.2倍柱体积/h用浓度为以体积计75%乙醇水溶液洗脱剂行洗脱，收集洗脱液，接着使用由上海亚荣生化仪器厂生产的旋转蒸发器在压力0.08MPa的条件下减压浓缩，至无液体流出为止，得到绿茶香料，同时回收醇；
将得到的绿茶香料进行检测，茶香料的折光是1.4690，密度是1.2000，酸值在10.2。
实施例2：绿茶特征香香料的制备方法，实施步骤如下：
A、有机溶剂提取：
将绿茶与醇或酮水溶液的重量比1:8，所述的绿茶在温度48℃与搅拌的条件下用浓度以体积计78%乙醇水溶液提取2.5小时，再以同样方式重复提取2次，提取液合并，接着使用由上海亚荣生化仪器厂生产的旋转蒸发器在压力0.08MPa的条件下进行减压浓缩，至无液体流出为止，得到浓缩物I，同时回收有机溶剂；
B、大孔吸附树脂吸附：
让步骤A得到的浓缩物I在流速1.5倍柱体积/h与室温的条件下通过由安徽三星树脂科技有限公司生产的AB-8型大孔吸附树脂柱，然后用去离子水淋洗至洗出液无色，再按照醇洗脱剂与大孔吸附树脂柱的体积比为3，以流量为2倍柱体积/h用浓度为以体积计75%乙醇水溶液洗脱剂行洗脱，收集洗脱液，接着使用由上海亚荣生化仪器厂生产的旋转蒸发器在压力0.08MPa的条件下减压浓缩，至无液体流出为止，得到浓缩物II，同时回收醇；
C、聚酰胺富集：
让步骤B得到的浓缩物II在流速0.8倍柱体积/h与室温的条件下通过由上海摩速科学器材有限公司生产的聚酰胺（型号是60-100）层析柱，然后用去离子水淋洗至洗出液无色，再按照醇洗脱剂与聚酰胺层析柱的体积比为3.5，以流量为2.0倍柱体积/h用浓度为以体积计85%乙醇水溶液洗脱剂行洗脱，收集洗脱液，接着使用由上海亚荣生化仪器厂生产的旋转蒸发器在压力0.08MPa的条件下减压浓缩，至无液体流出为止，得到绿茶香料，同时回收醇；
将得到的绿茶香料进行检测，茶香料的折光是1.4580，密度是1.1800，酸值在10.6。
实施例3：绿茶特征香香料的制备方法，实施步骤如下：
A、有机溶剂提取：
将绿茶与醇或酮水溶液的重量比1:12，所述的绿茶在温度58℃与搅拌的条件下用浓度以体积计83%乙醇水溶液提取3.5小时，再以同样方式重复提取2次，提取液合并，接着使用由上海亚荣生化仪器厂生产的旋转蒸发器在压力0.08MPa的条件下进行减压浓缩，至无液体流出为止，得到浓缩物I，同时回收有机溶剂；
B、大孔吸附树脂吸附：
让步骤A得到的浓缩物I在流速1.2倍柱体积/h与室温的条件下通过由日本三菱化学生产的HP20型大孔吸附树脂柱，然后用去离子水淋洗至洗出液无色，再按照醇洗脱剂与大孔吸附树脂柱的体积比为3.5，以流量为1.2倍柱体积/h用浓度为以体积计68%乙醇水溶液洗脱剂行洗脱，收集洗脱液，接着使用由上海亚荣生化仪器厂生产的旋转蒸发器在压力0.08MPa的条件下减压浓缩，至无液体流出为止，得到浓缩物II，同时回收醇；
C、聚酰胺富集：
让步骤B得到的浓缩物II在流速1.5倍柱体积/h与室温的条件下通过由上海摩速科学器材有限公司生产的聚酰胺（型号是100-120）层析柱，然后用去离子水淋洗至洗出液无色，再按照醇洗脱剂与聚酰胺层析柱的体积比为2.0，以流量为1.8倍柱体积/h用浓度为以体积计60%乙醇水溶液洗脱剂行洗脱，收集洗脱液，接着使用由上海亚荣生化仪器厂生产的旋转蒸发器在压力0.08MPa的条件下减压浓缩，至无液体流出为止，得到绿茶香料，同时回收醇；
将得到的绿茶香料进行检测，茶香料的折光是1.4490，密度是1.1600，酸值在9.5。