从微生物组水平上进行生物正交聚糖标记的方法及应用与流程

本发明涉及化学生物学领域，具体而言，涉及一种从微生物组水平上进行生物正交聚糖标记的方法及应用。

背景技术：

以化学生物学方法为切入点，通过在聚糖的生物合成过程中引入含有炔基或者叠氮等生物正交基团的前体单糖类似物(非天然糖)，达到标记细胞聚糖结构的目的。通过对非天然糖探针的设计，使它们可以进入细胞的糖生物合成机制，通过细胞代谢，最终被表达在细胞表面含聚糖结构上。最后通过生物正交反应(bioorthogonalreaction)可以在活细胞条件下引入探针分子，如荧光探针，生物素探针等。在细菌中也已有广泛的生物正交聚糖标记的报道，在几个有代表性的研究中，含有生物正交基团的不同非天然糖探针分别被代谢表达到了细菌的脂多糖、糖蛋白、糖脂等含聚糖结构上。通过在细菌中引入叠氮等生物正交基团，可以对一些常规培养难以检出的病原菌进行快速鉴定；也可通过在免疫刺激剂上引入端炔并偶联到含有叠氮的细菌表面，以提高免疫系统对这些细菌的特异性识别与杀伤。

作为原核生物，细菌中也和真核生物一样存在众多的糖蛋白表达，但由于技术手段的限制，与真核系统相比，到目前为止被鉴定的细菌糖蛋白数量有限。由于发现的很多细菌糖蛋白都是细菌感染过程中的毒力因子(virulentfactor)，因此更多新的细菌糖蛋白的发现对于理解致病菌或共生菌与人类宿主的相互作用关系重大。利用生物正交聚糖标记某种细菌(幽门螺旋杆菌)，并富集鉴定其中的新型糖蛋白已有报道，体现了聚糖标记对于发现细菌糖蛋白的重要作用。另一种利用多种凝集素(lectin)的方法富集细菌糖蛋白的方法也已见诸报道。

此外，由于微生物组的异质性和肠道环境的复杂性，肠道微生物研究领域的一个难点是在复杂的肠道环境中对细菌的成像观察。现有的方法主要包括：(1)将插入了荧光蛋白基因的改造细菌植入到宿主肠道中，利用荧光蛋白来对其进行定位。(2)利用荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization，fish)对肠道内的细菌进行观察。fish利用特定的荧光dna探针与细菌内的16srrna分子杂交来定位。(3)使用化学生物学方法标记肠道共生菌的方法最近也已有报道：利用某一种共生菌的聚糖生物合成过程中引入前体单糖类似物(非天然糖探针)的方法，再通过点击化学反应(clickreaction)偶联荧光基团，然后将这些仍有正常活性的细菌植入小鼠肠道进行定位追踪。

然而，在细菌中进行生物正交聚糖标记的报道都限于针对某一种特定的可以单独培养的细菌进行筛选，效率低，且对于无法单独培养的细菌(一般认为占所有细菌的95％以上)束手无策。针对细菌中新型糖蛋白的发现也同样存在这个问题，对于无法单独培养的细菌往往无法进行研究，对其中潜在的糖蛋白也无法了解。

上面提到的微生物组成像的几个常用方法各存在如下的问题(1)利用插入荧光蛋白的方法缺点在于>80％的肠道共生微生物无法进行单独体外培养，进而无法对其进行转基因操作。(2)fish存在dna探针设计复杂、低rrna含量、操作繁琐等问题，并且只限于检测事先知其存在，且引物可行性已验证的细菌，故其应用仍受很多限制。(3)使用化学生物学方法标记肠道共生菌的方法，其缺点在于仍需对特定细菌进行单独培养。

因此，仍需要对现有技术进行改进，以提供一种新的生物正交聚糖标记方法，为探究被标记上的细菌及其含聚糖结构的大分子的生物学功能提供有力的研究工具。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种从微生物组水平上进行生物正交聚糖标记的方法及应用，为特定微生物组的成像观察，以及为探究难以单独培养的细菌中含聚糖结构的大分子的生物学功能提供有力的研究工具。

为了实现上述目的，本发明提供了一种从微生物组水平上进行生物正交聚糖标记的方法，该方法包括：将微生物菌群置于添加有第一探针的培养基上进行培养，得到被第一探针标记的微生物菌群，第一探针为一种或多种非天然糖；将被第一探针标记的微生物菌群与第二探针进行生物正交反应，得到被第二探针标记的微生物菌群；第二探针为能够与第一探针进行生物正交反应的化学标记物。

进一步地，在得到被第二探针标记的微生物菌群之后，该方法还包括：从被第二探针标记的微生物菌群中分选出带有阳性标记的细菌。

进一步地，分选的方法包括流式细胞仪细胞分选法。

进一步地，在分选出带有阳性标记的细菌之后，该方法还包括：对带有阳性标记的细菌进行种类鉴定；和/或对带有阳性标记的细菌中的未知糖蛋白进行分离和鉴定。

进一步地，通过检测16srdna对带有阳性标记的细菌进行种类鉴定。

进一步地，非天然糖为含有生物正交基团的聚糖生物合成过程中的前体单糖类似物，生物正交基团选自含炔基、叠氮、端烯、甲基环丙烯中的任意一种；优选非天然糖为具有如下任一种结构的非天然糖：及其中，r＝n3，以及中的任意一种；更优选地，非天然糖选自如下任意一种：及

进一步地，第二探针为能够与第一探针进行生物正交反应的荧光基团、生物素、flag肽标签、his肽标签、avi肽标签、calmodulin肽标签、polyglutamate肽标签、e肽标签、ha肽标签、myc肽标签、s肽标签、sbp肽标签、softag1肽标签、softag3肽标签、strep肽标签、tc肽标签、v5肽标签、vsv肽标签以及xpress肽标签中的任意一种或几种的组合。

进一步地，微生物菌群为肠道微生物菌群，优选培养基为肠道微生物组培养基；更优选肠道微生物组培养基包括：酪蛋白胨0.06～1.5g、大豆胨0.04～1.0g、月示胨0.06～1.5g、消化血清粉0.12～3.0g、酵母浸膏0.03～0.75g、牛肉膏0.03～0.75g、牛肝膏0.02～0.4g、葡萄糖0.006～0.15g、可溶性淀粉0.06～1.5g、l-色氨酸0.003～0.048g、l-半胱氨酸盐酸盐4～100mg、巯基乙酸钠4～100mg、l-精氨酸12～300mg、维生素k10.1～1.0mg、血红素0.12～3.0mg、磷酸二氢钾0.03～0.75g、氯化钠0.04～1.0g、琼脂粉1～4g以及100～500ml的去离子水。

进一步地，将微生物菌群置于培养基上进行培养的步骤包括：将离体的带有微生物菌群的组织进行研磨并过滤，得到滤液；将滤液稀释后涂覆于培养基上进行培养。

进一步地，培养基中第一探针的浓度为1μm～100mm。

应用本发明的技术方案，通过在体外整体培养目的微生物组的方式，在培养过程中加入非天然糖探针的方式进行生物正交聚糖代谢标记，之后通过生物正交反应标记非天然糖探针，从而使无法单独培养的细菌以微生物菌群的方式得以培养并进行生物正交聚糖标记，便于后续从微生物组中分选出有标记信号的细菌进行菌种鉴定及相关含聚糖结构的大分子的生物学功能研究。与之前的单独培养某种细菌并逐个筛选能够被代谢标记所标记的方法相比较，本发明的方法能够实现快速、高通量地筛查多种能够被非天然糖所代谢标记的细菌，并且能够确定不同细菌所能够被代谢标记的非天然糖的具体种类，也为特定微生物组的体内成像提供了可能。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1a和图1b示出了根据本发明的一种优选的实施例中对肠道微生物组的标记结果，当利用不同的非天然糖探针时，可以实现不同细菌不同强度的标记，其中，图1a为负对照组(未添加非天然糖探针)，b行为8azkdo探针组(添加浓度为1mm)，图1b显示了探针组能够实现对大约40％的各种不同形态、不同强度的标记细菌的代谢标记；

图2示出了本发明另一种优选的实施例中对肠道微生物组中的糖蛋白的富集图；其中，左侧为银染图，右侧为western印迹图；经过ac4glcnaz(1mm)代谢标记的微生物群中的蛋白经过处理后，利用银染和westernblot都可以显示，相比负对照(nc，未添加非天然糖探针)，ac4glcnaz组中可见显著的糖蛋白富集；以及

图3a和图3b示出了本发明又一种优选的实施例中对肠道微生物组进行荧光观察图，将8azkdo探针(1mm)代谢标记的肠道微生物组利用灌胃的方式对小鼠进行处理后，利用双光子显微镜对小鼠的小肠进行原位成像观察，结果显示，相对比负对照(图3a)，实验组(图3b)的小鼠肠道中能够清楚地看到革兰氏阴性菌菌群在其中的分布。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术部分所提到的，目前我们对于不能单独培养的细菌中的糖蛋白一无所知，而目前已知的细菌糖蛋白中，很多都是毒力因子，与细菌的致病性直接相关。而现有的生物正交聚糖标记方法仅适用于个别的对能够单独培养的细菌进行标记，而对难以单独培养的细菌进行标记，因而这样标记方法的应用受到限制。

为了改善难以单独培养的细菌中含聚糖结构的大分子的研究状况，为该类分子的生物学功能提供有力的研究工具，在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种微生物组水平上生物正交聚糖标记的方法，该方法包括：将微生物菌群置于添加有第一探针的培养基上进行培养，得到被第一探针标记的微生物菌群，第一探针为一种或多种非天然糖；将被第一探针标记的微生物菌群与第二探针进行生物正交反应，得到被第二探针标记的微生物菌群；第二探针为能够与第一探针进行生物正交反应的化学标记物。

本发明所提供的上述微生物组水平上生物正交聚糖标记的方法，通过在体外整体培养目的微生物组的方式，在培养过程中加入非天然糖探针的方式进行生物正交聚糖代谢标记，之后通过化学标记非天然糖探针，从而使无法单独培养的细菌以微生物菌群的方式得以培养并进行生物正交聚糖标记，便于后续从微生物组中分选出有标记信号的细菌进行菌种鉴定及相关含聚糖结构的大分子的生物学功能研究。与之前的单独培养某种细菌并逐个筛选能够被代谢标记所标记的方法相比较，本发明的方法能够实现快速、高通量地筛查多种能够被非天然糖所代谢标记的细菌，并且能够确定不同细菌所能够被代谢标记的非天然糖的具体种类，也为特定微生物组的体内成像提供了可能。

上述方法在得到被第二探针标记的微生物菌群之后，可以根据具体研究目的不同和实验手段的便利性，选择不同的方法对上述被第一探针标记和第二探针的微生物菌群进行研究。在本发明一种优选的实施例中，在得到上述被第二探针标记的微生物菌群后，该方法还包括：从被第二探针标记的微生物菌群中分选出带有阳性标记的细菌。通过探针标记的方式能够追踪含有标记的细菌种类，通过分选出该类细菌，便于对该类细菌的生物学形态、行为及其功能进行深入研究。

对于上述分选阳性标记的细菌的方法，采用现有的分选方法即可。在本发明一种优选的实施例中，上述分选的方法包括流式细胞仪细胞分选法。流式细胞分选法采用流式细胞仪对对整个微生物菌群进行分选，其中被第二探针标记标记的细胞能够根据标记被单独分选出来。分选出来的阳性细菌，根据第二探针的种类的不同，进行荧光显微镜观察或者通过第二探针的抗体对带标记的分子进行结构和功能研究。

在本发明另一种优选的实施例中，根据实际研究领域和研究目的的不同，在分选出带有阳性标记的细菌之后，上述方法还包括：对带有阳性标记的细菌进行种类鉴定；和/或对带有阳性标记的细菌中的未知糖蛋白进行分离和鉴定。由于本发明的方法是从微生物组水平上对不同的菌种进行生物正交聚糖标记，便于从微生物菌群角度研究和理解特定种类的菌种在其所生存的微生态环境中的作用和行为。

上述优选实施例中对带有阳性标记的细菌进行种类鉴定可以采用现有的各种鉴定手段进行鉴定。本发明一种优选的实施例中，通过检测16srna对带有阳性标记的细菌进行种类鉴定。比如采用高通量测序的方式对所分选出来的16srna进行测序，并根据序列比对获得的不同菌种之间的序列差异来确定待鉴菌种。

上述对微生物菌群进行非天然糖标记过程中，可以采用现在已有的非天然糖，也可以采用对现有非天然糖改进的非天然糖，只要能够用于标记特定微生物菌种实现对带该标记菌种的种类鉴定和研究即可。在本发明一种优选的实施例中，非天然糖为含有生物正交基团的聚糖生物合成过程中的前体单糖类似物，生物正交基团选自含炔基、叠氮、端烯以及甲基环丙烯中的任意一种；优选非天然糖为具有如下任一种结构的非天然糖：

及其中，r＝n3，以及中的任意一种；更优选地，非天然糖选自如下任意一种：

及

上述具体种类的非天然糖分别是如下天然糖的类似物：

上述第二探针主要是用于对第一探针进行标记，利用第二探针所具有的可观察或可试验操作等性能，对特定类别的菌种以及该类别菌种中含有的第一探针的生物分子进行各方面的研究。因此，任何具有上述功能的第二探针都适用于本发明。包括商业化的可试验操作的抗体或标记分子等。在本发明一种优选的实施例中，第二探针选自荧光基团、生物素、flag肽标签、his肽标签、avi肽标签,calmodulin肽标签、polyglutamate肽标签、e肽标签、ha肽标签、myc肽标签、s肽标签、sbp肽标签、softag1肽标签、softag3肽标签、strep肽标签、tc肽标签、v5肽标签、vsv肽标签、xpress肽标签(上述肽标签为本领域常规的生化标签，具体序列采用商业化的即可)中的任意一种或几种的组合。

上述方法中的微生物菌群可以为任何难以实现单独培养的微生物菌群。本发明优选上述微生物菌群为离体的肠道微生物菌群。这些微生物菌群进行整体培养的培养方式采用现有的培养方式即可，只要其培养方式对其生物聚糖标记没有不利影响即可。在本发明一种优选的实施例中，上述微生物菌群的培养基为肠道微生物组培养基；更优选肠道微生物组培养基包括：酪蛋白胨0.06～1.5g、大豆胨0.04～1.0g、月示胨0.06～1.5g、消化血清粉0.12～3.0g、酵母浸膏0.03～0.75g、牛肉膏0.03～0.75g、牛肝膏0.02～0.4g、葡萄糖0.006～0.15g、可溶性淀粉0.06～1.5g、l-色氨酸0.003～0.048g、l-半胱氨酸盐酸盐4～100mg、巯基乙酸钠4～100mg、l-精氨酸12～300mg、维生素k10.1～1.0mg、血红素0.12～3.0mg、磷酸二氢钾0.03～0.75g、氯化钠0.04～1.0g、琼脂粉1～4g以及100～500ml的去离子水。采用上述含量范围的上述组分形成的肠道微生物组培养基，不仅使离体的肠道微生物菌群长势健康，而且不影响培养过程中对菌群进行非天然糖标记。

上述将微生物菌群置于培养基上进行培养的方法采用现有操作方法即可。本发明一种优选的实施例中，该步骤包括：将离体的带有微生物菌群的组织进行研磨并过滤，得到滤液；将滤液稀释后涂覆于培养基上进行培养。通过先对带有微生物菌群的组织进行研磨使得组织破碎，不同菌种的细胞释放进入滤液中。将滤液稀释(浓度过高抑制某些菌种生长)使得微生物菌群中的各类菌种浓度降低，然后涂覆于培养基上进行厌氧培养。

上述微生物组水平上生物正交聚糖标记的方法中，在微生物菌群生长正常的情况下，在培养基中添加第一探针，具体第一探针的添加浓度与培养的微生物菌群的浓度的不同而不同。在本发明一种优选的实施例中，上述培养基中第一探针的浓度为1μm～100mm。此处的μm和mm是μmol/l和mmol/l的简写。将第一探针的使用浓度控制在上述范围内，浓度相对适中，既能将相对较多的同类菌种进行标记，又能避免过多带来的非特异性标记。

下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

从清洁级(specific-pathogen-free,spf)c57/bl6成年小鼠(8-12周)三支，分成三组，每组一支。通过无菌操作取其大肠和小肠之后，分别用组织研磨器快速将其磨碎并用筛网(70mesh)过滤，将滤液稀释后均匀涂在一种特殊的肠道微生物组培养基(modifiedgifuanaerobemedia)(3组分别对应的培养基见表1)上，实验组的培养基中已提前加入1mm的非天然糖探针。在37℃无氧环境中培养5～7天后收集细菌，利用铜催化叠氮和炔的环加成反应偶联荧光基团。

表1：

之后在荧光显微镜下对样品进行观察，观察结果如图1a和图1b所示。其中，图1a为负对照组(未添加非天然糖探针)，图1b为8azkdo探针组(添加浓度为1mm)。图1b显示了探针组能够实现对大约40％的各种不同形态、不同强度的标记细菌的代谢标记。根据探针选择的不同，镜下可见不同形态的细菌被不同程度地标记。

同时，使用流式细胞仪细胞分选法(fluorescenceactivatedcellsorting，facs)分选出有阳性标记的细菌，提取其基因组dna并对其中的16srdna片段进行pcr扩增，测序以鉴定细菌种类。而且，当利用8azkdo进行标记时，facs的结果(未示出)显示可高达50％的体外培养的肠道细菌可被代谢标记，且根据16srdna测序分析的结果，被标记的细菌绝大部分属于革兰氏阴性菌，体现了本标记方法的特异性，因而可以特异性地实现对革兰氏阴性菌的成像观察。

可见，通过该实施例的对细菌的非天然糖代谢标记的方法，可以覆盖之前单独培养时无法进行研究的细菌种类，进而解决无法对这类难以单独培养的细菌进行研究的问题。利用如ac4galnaz或者ac4glcnaz等代谢标记的菌群能够实现对肠道菌群中一些糖蛋白的代谢标记，从而为发现、富集、鉴定这些之前未知的细菌糖蛋白提供了目前唯一可行的办法。即利用在体外培养肠道微生物组体系中加入非天然糖探针的方式进行的代谢标记，实现了对之前无法单独培养的细菌种类(一般认为占全部肠道菌群种类的80％以上)的代谢标记研究，为探究这些细菌中的含聚糖结构(包括脂多糖，细胞壁，糖蛋白等)提供了有力的研究工具。

在上述培养过程中添加的第一探针，这些第一探针可以包含炔基或者叠氮等生物正交基团，也可以包含其他的能进行代谢标记的探针类型，包括但不限于含有端烯、甲基环丙烯等正交基团的探针。培养完成后进行的偶联荧光基团的反应使用了铜催化叠氮和炔的环加成反应，也可以使用其他的生物正交反应，例如staudingerligation等，除偶联荧光基团之外也可以偶联生物素(biotin)、flag肽标签、his肽标签、avi肽标签,calmodulin肽标签、polyglutamate肽标签、e肽标签、ha肽标签、myc肽标签、s肽标签、sbp肽标签、softag1肽标签、softag3肽标签、strep肽标签、tc肽标签、v5肽标签、vsv肽标签或者xpress肽标签。上述利用facs分选、提取菌群基因组dna和16srdna进行测序的步骤采用现有操作步骤。

实施例2

采用与实施例1相同的方法，使用ac4galnaz或者ac4glcnaz代谢标记完成的菌群(约20mg)，利用pbs洗2次之后，裂解(超声裂解或使用细菌裂解液)之后，离心(10,000xg，15min)，取上清，加入炔基生物素(0.1mm)，利用铜催化叠氮和炔的环加成反应，将带有叠氮标签的细菌糖蛋白偶联上biotin之后，利用无水甲醇将蛋白沉淀，离心(4,000xg，15min)，再用甲醇洗三次之后，利用蛋白复溶液复溶蛋白，加入strepavidinagarose微球将有biotin标记的蛋白富集，充分洗涤微球除去非特异性吸附的蛋白，最后利用sds-page上样使用的loadingbuffer将富集的糖蛋白从微球上脱离，利用sds-page对样品中的蛋白进行分析，后续可以使用银染或者westernblot观察所富集到的细菌中的糖蛋白(具体步骤见jacs.2014,136(35):12283-95)。

具体结果见图2。图2中，左侧为银染图，右侧为western印迹图；经过ac4glcnaz(1mm)代谢标记的微生物群中的蛋白经过处理后，利用银染和western印迹都可以显示，相比负对照(nc，未添加非天然糖探针)，ac4glcnaz组中可见显著的糖蛋白富集。

通过这种方式，可以对之前无法进行培养的大量细菌种类中的未知糖蛋白进行富集，分离和鉴定。可见，利用某些特定的非天然糖探针即可以针对性地标记细菌中可能存在的糖蛋白。同时采用这种微生物组整体培养的方式，可以标记到之前无法单独培养的细菌中可能存在的糖蛋白。之后裂解细菌，在菌液中将标记到的糖蛋白链接上生物素，利用修饰有链霉亲和素的微球对这些蛋白进行富集，通过这种方式能够发现之前未知的细菌糖蛋白。

实施例3

使用8azkdo代谢标记完成的菌群(20mg)，其中的革兰氏阴性菌被特异性地标记，利用铜催化叠氮和炔的环加成反应偶联炔基-tamra(20μm)之后，使用pbs洗5次，最后得到的细菌重悬于500μlpbs中。使用此样品对模型小鼠(c57/bl6)进行灌胃处理(200μl)，经过4～6小时之后，对小鼠肠道内的革兰氏阴性菌的分布进行观察。观察的方法包括使用双光子显微镜对小鼠肠道内的菌群进行体内的活体成像，也可以将小鼠肠道分离出之后，进行冷冻切片处理，利用荧光显微镜对革兰氏阴性菌在肠道中的分布进行观察。

将8azkdo探针(1mm)代谢标记的肠道微生物组利用灌胃的方式对小鼠进行处理后，利用双光子显微镜对小鼠的小肠进行原位成像观察，观察结果见图3a和图3b。结果显示，相比负对照(图3a)，实验组(图3b)的小鼠肠道中能够清楚地看到革兰氏阴性菌菌群在其中的分布(参见箭头所指之处)。

通过这种方法，可以对小鼠体内的革兰氏阴性菌这个特定的菌群进行活体观察，这是此前无法实现的。可见，利用肠道菌群整体培养的过程中实现的代谢标记，根据选用的探针不同，可实现对某些特定菌群的标记。利用这种方法得到的样品对模型小鼠进行灌胃处理后，可以实现对小鼠肠道中特定微生物组的在活体状态下的分布观察，这种效果无法通过现有的任何手段实现。

由上述实施例可知，本发明上述的通过在体外整体培养肠道微生物组的方式，可以培养出之前无法单独培养的细菌。通过在这个过程中加入某种非天然糖探针的方式，可以进行生物正交聚糖代谢标记。之后偶联荧光探针，利用流式细胞荧光分选技术(facs)分选出有标记信号的细菌，再通过16srdna测序的方法对分选出的细菌进行鉴定。与之前的单独培养某种细菌，逐个筛选能被代谢标记探针的方法相比较，本发明可以实现快速、高通量地筛查哪些细菌可以被哪些非天然糖所代谢标记。

针对肠道微生物组成像的问题，利用这种微生物组整体培养的方式，在其中加入能特异性标记革兰氏阴性菌的探针，即可实现对肠道微生物组中革兰氏阴性菌的标记。通过点击化学反应链接荧光基团后，将菌群利用灌胃的方式送入小鼠体内，一定时间后即可通过组织切片或者双光子活体成像的手段实现对小鼠肠道中革兰氏阴性菌分布的观察。这种方法无需进行复杂的转基因操作或dna探针设计，并且能实现活体中对活的特定菌群的观察。

从以上的描述中，可以看出，本发明的方案相比现有技术实现了如下技术效果：

1)实现高效率，高覆盖率的细菌代谢标记，能够高通量地筛选可以用非天然糖探针进行代谢标记的细菌种类。

2)能够发现肠道菌群中未知的细菌糖蛋白并实现富集，利于对这些蛋白的生物学功能进行深入研究。

3)利用简单易操作的方法，实现对某些特定肠道菌群的活体、原位观察。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。