体外检测免疫细胞杀伤效率的方法与流程

本发明涉及细胞培养领域，具体地，涉及体外检测免疫细胞杀伤效率的方法。

背景技术：

治疗肿瘤是人类的最大挑战，通常需要采用综合治疗方法，包括手术切除肿瘤、放疗、化疗，但这些方法存在肿瘤迁移与复发的危险，而且具有严重损伤正常组织和免疫功能的副作用。半个世纪生命科学积累表明肿瘤实际上是机体免疫系统不能监护和清除时时刻刻在突变细胞的积聚，从而蚕食正常机体机能，最终危机患者的生命。而提高机体免疫力治疗肿瘤则成为现代生物学对肿瘤治疗最大贡献，细胞免疫治疗通过恢复和增强肿瘤患者的免疫监视能力和杀伤功能，清除手术和放化疗后患者体内残存的肿瘤细胞，达到预防复发及转移，达到根治肿瘤的目的，具有特异性强、毒副作用小等特点。从而成为肿瘤综合治疗的一个必不可少的组成部分，其中肿瘤细胞免疫治疗是一种崭新的、最具有显著疗效的肿瘤治疗方式之一。

根据免疫细胞治疗的特点及抗肿瘤的机制细胞免疫治疗可分为主动性免疫治疗和过继性细胞免疫治疗，或特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗。目前肿瘤细胞免疫治疗研究主要集中在过继性免疫治疗，利用体外扩增的免疫细胞，如细胞因子诱导的杀伤细胞(cik细胞)、dc细胞、nk细胞、基因修饰的t细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞(lak细胞)、肿瘤浸润的淋巴细胞(til细胞)等进行肿瘤的治疗。通过激发或调动机体的免疫功能，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞的目的，是继传统疗法(手术、化疗和放疗)、靶向疗法后肿瘤治疗领域又一项突出有效的治疗方式。

肿瘤细胞免疫治疗是现在科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法。具体涉及的是通过一定手段采集或分离得到人体自身免疫细胞，经过体外诱导、培养后，得到数量增多、靶向杀伤性增强的各种免疫细胞(如cik细胞、nk细胞、til细胞、dc细胞等)，这些细胞可释放穿孔素/颗粒酶，穿孔素在癌细胞表面穿孔，使颗粒酶进入细胞内诱导癌细胞凋亡；或者分泌大量细胞因子，直接作用癌细胞或激活其他免疫细胞杀伤癌细胞，把这些免疫细胞回输到人体，达到杀灭血液和组织中的癌细胞。这种方法打破免疫耐受，激活和增强机体自身的免疫能力，达到治疗和保健的双重功效。

淋巴细胞作为免疫细胞中最重要的一类，是现今肿瘤免疫细胞治疗研究中的焦点。当淋巴细胞在体外与靶细胞接触时，可表现出破坏和溶解靶细胞的特性，称为淋巴细胞毒作用(cytotoxicity)。靶细胞可以是肿瘤细胞或其它组织细胞。淋巴细胞杀伤靶细胞的方式可通过直接杀伤或产生淋巴因子破坏靶细胞。淋巴细胞毒性实验是评价体外培养淋巴细胞对靶细胞杀伤效率的重要方法。常规采用的操作方法是把淋巴细胞与人白血病细胞系k562进行共培养，检测经过淋巴细胞杀伤后残余k562细胞的活性来反映淋巴细胞的杀伤效率。其中存在的问题是k562细胞是血液系统肿瘤细胞系，呈悬浮状态，并且在细胞大小上，与淋巴细胞差别不是很明显，这就造成我们只能通过检测残余k562细胞的活力来反映淋巴细胞的杀伤效率。这就造成实验结果不太稳定，操作不简便易行。

因此，本领域迫切需要开发一种可直观准确的检测免疫细胞对靶细胞杀伤效率以及可从贴壁细胞数目的减少情况和形态的改变情况来判断免疫细胞杀伤靶细胞的能力的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种可直观准确的检测免疫细胞对靶细胞杀伤效率以及可从贴壁细胞数目的减少情况和形态的改变情况来判断免疫细胞杀伤靶细胞的能力的方法。

本发明的第一方面提供了一种非治疗性和非诊断性的检测免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率的方法，包括步骤：

(i)提供一培养体系，在适合培养的条件下，在所述培养体系中培养肿瘤细胞，从而获得含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系，其中所述肿瘤细胞为实体肿瘤细胞系；

(ii)向所述的含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系中加入免疫细胞，共培养一段时间，获得含有肿瘤细胞和免疫细胞的混合培养体系；和

(iii)在显微镜下观察所述肿瘤细胞的形态以及存活的肿瘤细胞的数量，从而测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。

在另一优选例中，在步骤(iii)之前,还包括用洗脱法处理免疫细胞的步骤。

在另一优选例中，在向所述的含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系中加入免疫细胞之前，对所述肿瘤细胞进行计数。

在另一优选例中，设立对照组，所述对照组中仅含有肿瘤细胞，不含有所述免疫细胞，计算对照组中肿瘤细胞的数量。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(iv)，用其他检测方法进一步测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。

在另一优选例中，用洗脱法处理免疫细胞后，用以下公式测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率：杀伤效率＝1-共培养组细胞活力/肿瘤细胞对照组细胞活力；

其中，共培养组细胞活力指免疫细胞和肿瘤细胞共培养后，存活细胞的细胞活力；肿瘤细胞对照组细胞活力指平行于共培养组设置的单独肿瘤细胞培养组的细胞活力。

在另一优选例中，不经洗脱法处理免疫细胞，用以下公式测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率：杀伤效率＝1-(共培养组细胞活力-免疫细胞对照组细胞活力)/肿瘤细胞对照组细胞活力；

其中，共培养组细胞活力指免疫细胞和肿瘤细胞共培养后，存活细胞的细胞活力；肿瘤细胞对照组细胞活力指平行于共培养组的单独的肿瘤细胞的细胞活力；免疫细胞对照组细胞活力指平行于共培养组设置的单独免疫细胞培养组的细胞活力。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞选自下组：肺癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、其他类型肿瘤细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞选自下组：肺癌细胞系a549、乳腺癌细胞系mcf-7、肝癌细胞系hepg2、其他类型肿瘤细胞系、或其组合。

在另一优选例中，步骤(i)中，所述的培养体系中，所述肿瘤细胞的培养密度为1000-10000个细胞/0.1ml，较佳地，2000-8000个细胞/0.1ml，更佳地，3000-6000个细胞/0.1ml。

在另一优选例中，步骤(i)中，所述的培养体系为96孔板。

在另一优选例中，步骤(i)中，所述的培养体系的体积为30-250μl，较佳地40-200μl，更佳地50-150μl。

在另一优选例中，步骤(i)中，所述肿瘤细胞的培养时间为0-48h，较佳地，2-24h。

在另一优选例中，步骤(i)中，所述肿瘤细胞的培养温度为35-39℃，较佳地，36-38℃。

在另一优选例中，步骤(ii)中，所述免疫细胞选自下组：淋巴细胞。

在另一优选例中，步骤(ii)中，所述免疫细胞与肿瘤细胞的效靶比为1-100：1，较佳地，10-50：1，更佳地，20-50：1。

在另一优选例中，步骤(ii)中，所述共培养的时间为0.5-96h，较佳地，1-48h，更佳地，2-24h。

在另一优选例中，步骤(iv)中，所述其他检测方法选自下组：mtt法、ldh释放法、celltiter检测方法、或其组合。

在另一优选例中，步骤(ii)中，所述免疫细胞的密度为0.2×10⁴－1×10⁶个细胞/0.1ml，较佳地，0.5×10⁴－8×10⁵个细胞/0.1ml，更佳地，1×10⁴－3×10⁵个细胞/0.1ml。

在另一优选例中，步骤(ii)中，所述共培养的温度为35-39℃，较佳地，36-38℃。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了倒置荧光显微镜10倍物镜下观察的拍照结果，可以看到淋巴细胞与肿瘤细胞共培养组中，淋巴细胞把肿瘤细胞都包围覆盖了，大部分地方看不到肿瘤细胞，极少数地方可以看到有变形的肿瘤细胞，这说明淋巴细胞识别并攻击肿瘤细胞。

图2显示了倒置荧光显微镜20倍物镜下观察的拍照结果，为图1实验结果高倍镜下的观察结果，更明显地反映出靶向肿瘤细胞被杀伤的效果。

图3显示了倒置荧光显微镜4倍物镜下观察的拍照结果。

图4显示了倒置荧光显微镜4倍物镜下观察的拍照结果。

图5显示了倒置荧光显微镜4倍物镜下观察的拍照结果。

在图3-图5中，正常情况下，贴壁生长好的肿瘤细胞很难被移液枪吹洗下来，在加入淋巴细胞共培养后，经过淋巴细胞杀伤过的肿瘤细胞，因为细胞死亡或者将要死亡，细胞没有贴壁性或贴壁性很差，则很容易被吹洗下来，图片结果为淋巴细胞与肿瘤细胞共培养处理后，用pbs缓冲液进行吹洗前后的拍照结果，对照组和实验组平行操作。可以看出单独的肿瘤细胞在吹洗前后基本没有变化，而共培养组的细胞在吹洗后，基本都掉落，这说明肿瘤细胞基本被淋巴细胞全部杀伤或杀死。

具体实施方式

本发明人经过长期广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，首次意外地发现，将肿瘤细胞(如实体肿瘤细胞系)和免疫细胞(如淋巴细胞)进行共培养一段时间，借助显微镜可直观的观察到肿瘤细胞的形态和存活的肿瘤细胞的数量，还可准确的计算出免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。在此基础上，本发明人完成了本发明。

如本文所用，术语“其他类型肿瘤细胞或细胞系”指不局限于肺癌、肝癌和乳腺癌，还可以是胃癌、鼻咽癌、食管癌、大肠癌、宫颈癌等类型的肿瘤细胞或细胞系。

检测方法

对于杀伤试验中的靶细胞，针对不同的癌症种类，选择相应的人肿瘤细胞系，主要采用的是贴壁生长的细胞系。提前一定时间，可以是2小时到24小时，或更长时间铺设一定数量的肿瘤细胞，具体数量可采用96孔板每孔10³-10⁴个细胞，提前让肿瘤细胞能很好地贴壁生长，之后按照一定的效靶比，例如5:1、10:1、20:1、50:1、100:1等等，加入分离得到或体外诱导培养得到的免疫细胞，进行共培养，结果观察和检测的时间可根据实际情况调整，可以是2小时到24小时，或者共培养更长的时间。结果判断，可选择以下方法：形态检查法、洗脱法等。

形态检查法是指共培养结束后，直接在显微镜下观察免疫细胞分布的变化以及肿瘤细胞数量和形态的改变。绝大部分肿瘤细胞的体积比淋巴细胞大，且成贴壁生长，贴壁生长的肿瘤细胞如果在非常规消化的情况下脱落，则基本判断为即将死亡或死亡细胞。具体来说，如果杀伤效率很好的免疫细胞与肿瘤细胞进行共培养，可明显观测到免疫细胞包围肿瘤细胞，形成细胞杀伤团，肿瘤细胞数量明显减少或直接没有贴壁的细胞。正是存在这种对比，可以很直观地通过显微观察进行免疫细胞杀伤效率的大致判断。

洗脱法是指针对贴壁的肿瘤细胞，在共培养结束后，采用pbs缓冲液或其他细胞培养相关液体对共培养的体系进行轻柔地洗脱操作，洗去悬浮的免疫细胞和死亡脱落的肿瘤细胞，再直接通过显微镜观察存活的贴壁肿瘤细胞情况，从而判断出免疫细胞的杀伤效率。

在本发明中，通过改变靶细胞的选择种类，采用各种贴壁生长的肿瘤细胞系作为检测的靶细胞，结合不同的检测方法，例如形态检查法、洗脱法和细胞荧光染料追踪法进行检测，从贴壁细胞数目的减少情况和形态的改变情况来判断淋巴细胞杀伤靶细胞的能力。

本发明可以作为体外测定肿瘤患者细胞免疫的指标，也可以通过测定机体免疫活性细胞杀伤肿瘤细胞的能力，来判断肿瘤患者的治疗效果，还可以鉴定淋巴细胞的功能性亚群。

在一优选实施方式中，所述检测免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率的方法，包括步骤：

(i)提供一培养体系，在适合培养的条件下，在所述培养体系中培养肿瘤细胞，从而获得含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系，其中所述肿瘤细胞为实体肿瘤细胞系；

(ii)向所述的含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系中加入免疫细胞，共培养一段时间，获得含有肿瘤细胞和免疫细胞的混合培养体系；和

(iii)在显微镜下观察所述肿瘤细胞的形态以及存活的肿瘤细胞的数量，从而测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。

在一优选实施方式中，本发明还可结合mtt法、ldh释放法、celltiter检测方法等方法进一步测定免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。

本发明的检测方法不仅可直观的观察到肿瘤细胞的形态以及存活的肿瘤细胞的数量，还可更精确的计算出免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次通过改变靶细胞的选择种类，采用各种贴壁生长的肿瘤细胞系作为检测的靶细胞，结合不同的检测方法，例如形态检查法、洗脱法和细胞荧光染料追踪法进行检测，从贴壁细胞数目的减少情况和形态的改变情况来判断淋巴细胞杀伤靶细胞的能力。

(2)本发明对淋巴细胞杀伤效率的检测提供了更加灵活的检测方法，可用显微镜直接观察肿瘤细胞的形态以及存活的肿瘤细胞的数量，也可在显微镜观察前先用洗脱法处理细胞，再观察肿瘤细胞，直接根据不同的实验室条件(比如实验仪器或者试剂的限制等等)和不同的实验目的，可以灵活选择不同的判断方法。

(3)本发明可以作为体外测定肿瘤患者细胞免疫的指标，也可以通过测定机体免疫活性细胞杀伤肿瘤细胞的能力，来判断肿瘤患者的治疗效果，还可以鉴定淋巴细胞的功能性亚群。

(4)本发明不仅可直接用显微镜观察肿瘤细胞的形态以及存活的肿瘤细胞的数量，还可以附加地采用mtt相关试剂和酶标仪进行细胞活力检测，从而获得更精确的杀伤效率(＞90％)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

本发明实施例中所用的材料如无特别说明，均为市售产品。

实施例1用形态检查法检测淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

(1)靶细胞的接种：选用能贴壁生长的肿瘤细胞，本实施例选择三种常见癌症的相应细胞系，分别为人肺癌细胞系a549(购自中科院上海细胞库)、人乳腺癌细胞系mcf-7(购自中科院上海细胞库)和人肝癌细胞系hepg2(购自中科院上海细胞库)。肿瘤细胞经pbs缓冲液洗涤后用2.5g/l胰酶消化2～3min，显微镜下观察，确保细胞消化好之后，用含10％～20％小牛血清的dmem细胞培养液(购自赛默飞公司)将贴壁细胞冲洗下来，离心去掉上清，再用培养液重悬细胞，计数细胞个数，调整细胞浓度，根据实际情况，96孔板的总体积为50-150μl，每孔可加4000个肿瘤细胞(0.1ml体积中)，置培养板于37℃含5％co2细胞培养箱中培养24h。

(2)分离培养淋巴细胞：取受检者肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分层液分离得到淋巴细胞后，采用淋巴细胞生长培养液(包含人il2、人cd137l等因子，购自invitrogen公司)进行细胞体外培养，根据需要选择用于试验用的效应细胞，用培养基配成细胞悬液待用。

(3)细胞杀伤实验：淋巴细胞和靶细胞按效靶比例20∶1混合，每孔中加入8×10⁴个淋巴细胞(0.1ml体积中)，置培养板于37℃5％co2细胞培养箱中24h。

(4)结果检测：采用倒置显微镜进行观察，可采用不同放大倍数的物镜进行观察。对比单独淋巴细胞组和单独肿瘤细胞组，可以观察到共培养试验组的淋巴细胞和肿瘤细胞的分布和形态都发生变化，贴壁的肿瘤细胞很少或直接没有，淋巴细胞和脱落的肿瘤细胞形成各种杀伤团。低倍物镜可观察到整体的肿瘤细胞存活情况(图1)，高倍物镜可明显观察到杀伤团的具体情况(图2)。

结合mtt细胞活力检测法，可以用下述公式计算淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。

公式：杀伤效率＝1-(共培养组细胞活力-淋巴细胞对照组细胞活力)/肿瘤细胞对照组细胞活力。

其中，细胞活力是指通过添加细胞活力检测试剂(类似mtt(噻唑蓝))，继续培养3-24小时(具体根据之后所采用的溶解结晶产物的方法来定)之后，检测外源性mtt被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臢(死细胞无此功能)，再采用可以溶解甲臢的试剂(例如二甲基亚砜)来溶解结晶，之后采用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(od值)，来判断活细胞数量。共培养组细胞活力指淋巴细胞和肿瘤细胞共培养后，存活细胞的细胞活力；肿瘤细胞对照组细胞活力指平行于共培养组设置的单独肿瘤细胞培养组的细胞活力。

结果表明，这种方法不仅可直观明了地体现出淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，还可准确的计算出淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效率(大约在90％以上)，肿瘤细胞基本都被淋巴细胞所包围，形成杀伤细胞团。

用上述方法测定淋巴细胞对其他类型的肿瘤细胞(如胃癌、鼻咽癌、食管癌、大肠癌、宫颈癌)的杀伤效率，结果表明，其他类型的肿瘤细胞的杀伤效果与乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞相似。

实施例2用洗脱法检测淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

(1)靶细胞的接种：选用能贴壁生长的肿瘤细胞，本实施例选择三种常见癌症的相应细胞系，分别为人肺癌细胞系a549(购自中科院上海细胞库)、人乳腺癌细胞系mcf-7(购自中科院上海细胞库)和人肝癌细胞系hepg2(购自中科院上海细胞库)。肿瘤细胞经pbs缓冲液洗涤后用2.5g/l胰酶消化2～3min，显微镜下观察，确保细胞消化好之后，用含10％～20％小牛血清的dmem细胞培养液(购自中科院上海细胞库)将贴壁细胞冲洗下来，离心去掉上清，再用培养液重悬细胞，计数细胞个数，调整细胞浓度，根据实际情况，96孔板每孔可加4000个肿瘤细胞(0.1ml体积中)，置培养板于37℃含5％co2细胞培养箱中培养24h。

(2)分离培养淋巴细胞：取受检者肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分层液分离得到淋巴细胞后，采用采用淋巴细胞生长培养液(包含人il2、人cd137l等因子，购自invitrogen公司)进行细胞体外培养，根据需要选择用于试验用的效应细胞，用培养基配成细胞悬液待用。

(3)细胞杀伤实验：淋巴细胞和靶细胞按效靶比例20∶1比例混合，每孔中加入8×10⁴个淋巴细胞(0.1ml体积中)，置培养板于37℃5％co2细胞培养箱中24h。

(4)结果检测：共培养结束后，去掉上清，重新加入pbs缓冲液或细胞培养相关液体洗脱漂浮细胞，可重复洗脱一次，之后加入培养基，在倒置显微镜下观察剩余的贴壁肿瘤细胞的情况。

结果如图3至图5所示，通过把悬浮细胞洗脱掉，在低倍镜下观察，可以很清楚地观察到肿瘤细胞的残余情况，间接反映出淋巴细胞的杀伤效率。

结合mtt细胞活力检测法，可以用以下公式计算淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。

公式：杀伤率＝1-共培养组细胞活力/肿瘤细胞对照组细胞活力。

其中，细胞活力是指通过添加细胞活力检测试剂(类似mtt(噻唑蓝))，继续培养3-24小时(具体根据之后所采用的溶解结晶产物的方法来定)之后，检测外源性mtt被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臢(死细胞无此功能)，再采用可以溶解甲臢的试剂，例如二甲基亚砜来溶解结晶，之后采用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(od值)，来判断活细胞数量。共培养组细胞活力指淋巴细胞和肿瘤细胞共培养后，存活细胞的细胞活力；肿瘤细胞对照组细胞活力指平行于共培养组的单独的肿瘤细胞的细胞活力；淋巴细胞对照组细胞活力指平行于共培养组设置的单独淋巴细胞培养组的细胞活力。

共培养在洗脱后，没有残余的肿瘤细胞。结果显示，免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率为100％。

结果表明，这种方法不仅可直观明了地体现出淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，还可准确的计算出淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。

用上述方法测定淋巴细胞对其他类型的肿瘤细胞(如胃癌、鼻咽癌、食管癌、大肠癌、宫颈癌)的杀伤效率，结果表明，其他类型的肿瘤细胞的杀伤效果与乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞相似。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。