本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水蛭活性肽的制备方法。
背景技术：
水蛭作为一味传统中药，历史悠久，中医认为水蛭有破血、逐淤、通经等功效。经研究表明，中药水蛭有显著的降血脂作用，并使主动脉粥样硬化斑块明显减退，斑块内可见胶原纤维增生，胆固醇结晶减少。为中药水蛭防治动脉粥样硬化、防治多种心脑血管疾病提供了一定的理论依据。同时还发现用中药水蛭治疗血栓性静脉炎、肝硬化、呼吸系统疾病都取得了满意的效果。
专利cn201710412958.5公开了“一种水蛭蛋白多肽粉及应用”，此发明通过以下步骤制备：预处理：取天然水蛭，加入氯化钠溶液浸泡；磨浆：匀浆，滤去杂质，得到浆液；改性：结合微波对浆液进行处理，得到改性溶液；水解：在改性溶液中加入木瓜蛋白酶，调节ph为4.5～6，结合微波对改性溶液进行水解处理，然后降温至4～10℃，恒温放置；结合微波进行处理，停止反应，得到水解溶液；灭活：将水解溶液加热灭活；过滤：过滤取滤液；干燥：将滤液干燥，得到水蛭蛋白多肽粉；单酶酶解效率低下，且利用微波处理无聊在能耗还是设备要求上都远远高于了热处理，不利于成本以及工业化。
技术实现要素：
本发明第一目的在于提供一种水蛭活性肽的制备方法，该方法制得的水蛭活性肽多肽含量高，营养价值丰富，且具有良好的免疫作用。
本发明的另一目的在于提供一种含有水蛭活性肽的组合物。
本发明的再一目的在于提供所述含有水蛭活性肽的组合物的制备方法。
本发明的水蛭活性肽的制备方法，包括如下步骤：
a、将水蛭粉加入水，调节ph至8～9，浸泡18～22小时，固液分离，取上清液；
b、将所述上清液调节ph至4～6进行沉淀，固液分离，取固体部分；
c、将所述固体部分加入水，于80～100℃下加热20～40min，然后进行均质，得到混悬液；
d、将所述混悬液调节ph至5～9，加入酶制剂进行酶解；所述酶制剂由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，且所述胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量比为3～5∶1～2，酶解温度为40～60℃，酶解时间为2～7h，得到酶解液；
e、将所述酶解液灭酶处理，然后制成水蛭活性肽粉。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤b中，采用弱酸将所述上清液调节ph至4～6；所述弱酸选自醋酸、乳酸、柠檬酸中的至少一种。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤e中，所述灭酶处理的温度为90～120℃，时间为0.5～3h。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤e中，将所述灭酶处理后的酶解液浓缩，均质乳化，然后喷雾干燥，得到水蛭活性肽粉；所述喷雾干燥在80～105℃下进行。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤e中，将所述灭酶处理后的酶解液进行离心，离心液首先经板框压滤机过滤，再经陶瓷膜过滤，得到活性肽透过液；将所述活性肽滤液浓缩，喷雾干燥，从而得到水蛭活性肽粉；所述喷雾干燥在80～105℃下进行；所述板框压滤机内含有组合过滤助剂，所述组合过滤助剂由活性炭、珍珠岩和硅藻土按照重量比5～6∶1～2∶1～2组成。
本发明还提供一种水蛭活性肽，该水蛭活性肽采用上述方法制备得到。
本发明还提供一种含水蛭活性肽的组合物，其由水蛭活性肽70～90重量份、余甘子5～15重量份和桑叶5～15重量份制成。
本发明还提供一种所述含水蛭活性肽的组合物的制备方法，所述制备方法包括：(1)采用上述方法制备水蛭活性肽粉；(2)将余甘子和桑叶混合后用水作为溶剂提取，提取液浓缩，干燥，粉碎，得到药材提取物；(3)将所述水蛭活性肽粉和药材提取物混合均匀，得到所述组合物。
本发明的含水蛭活性肽的组合物的制备方法，将水蛭活性肽与余甘子、桑叶配伍，能够提升制备的水蛭活性肽的营养成分保健功能。余甘子和桑叶对机体的主要作用如下：
余甘子：余甘果又名牛甘果，油甘果，因其吃起来“先苦后甜”得名。目前市场上也有野生牛甘果卖和水果型牛甘果两种。与野生牛甘果相比，水果型牛甘果具有果大、肉厚、纤维少、营养丰富、产量高、效益好等特点，而且吃起来更加甘甜爽口。具有丰富的维生素c、e、b、多种微量元素及矿物质，同时还含有人体所需的14种氨基酸以及超氧化物歧化酶(sod)和丰富的有机硒，尤其是维生素c，每100克鲜余甘果中含维生素c500-1841毫克，比素有维生素之王猕猴桃高4倍，比柑桔高25倍，具有多种保健医疗作用。余甘子果实味酸微涩，清热凉血，消食健脾，生津止渴。主治血热血瘀，消化不良，腹胀，咳嗽，喉痛，口干及维生素c缺乏症。近年研究结果表明，余甘子具有抗炎，抗氧化，抗衰老，保肝等作用。桑叶：桑叶味辛、性温，具有温中降逆、补肾助阳的作用。它还是一味很好的温胃药，对由寒邪引起的胃痛、呕吐、呃逆、腹痛、泄泻以及妇女寒性痛经等，均有良好的疗效，它还可缓解腹部胀气，增强消化能力，减轻恶心呕吐，尤其是孕妇害喜症状。桑叶：桑叶是上好的功能食品，能够降压，降血脂，抗衰老，增加耐力，降低胆固醇，抑制脂肪积累，抑制血栓生成，抑制肠内有害细菌繁殖，抑制有害的氧化物生成，最突出的功能是防治糖尿病。赤小豆：为豆科植物，赤小豆具备利水消肿，解毒排脓等功效。可用于治疗水肿胀满、脚气浮肿、黄疸尿赤、风湿热痹、痈肿疮毒、肠痈腹痛等。此两种成分均可将胆固醇及盐分对身体不必要的成分排泄出体外，因此被视为具有解毒的效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
<水蛭活性肽的制备方法及水蛭活性肽>
本发明的水蛭活性肽的制备方法，包括如下步骤：
a、将水蛭粉加入水，调节ph至8～9，浸泡18～22小时，固液分离，取上清液；
b、将所述上清液调节ph至4～6进行沉淀，固液分离，取固体部分；
c、将所述固体部分加入水，于80～100℃下加热20～40min，然后进行均质，得到混悬液；
d、将所述混悬液调节ph至5～9，加入酶制剂进行酶解；所述酶制剂由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，且所述胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量比为3～5∶1～2，酶解温度为40～60℃，酶解时间为2～7h，得到酶解液；
e、将所述酶解液灭酶处理，然后制成水蛭活性肽粉。
根据本发明的制备方法，步骤a中，所述水蛭粉的粒径为4～70μm。所述水蛭粉可以通过将干水蛭进行超微粉碎，然后过筛得到，例如过200～600目筛。采用本发明的粒径的水蛭粉，能够在后期的酶解步骤中有效提高酶解率，充分利用水蛭中的蛋白成分。所述浸泡优选为在搅拌下进行浸泡，从而使水蛭粉中的成分充分溶出。步骤a中，加水量为水蛭粉重量的3～8倍，优选为3～5倍。优选地，在浸泡工序完成后，进行机械搅拌，从而使液体均匀，便于离心。
步骤a中，所述固液分离方法可以为过滤、离心等，并优选为离心分离。步骤a中，浸泡过程可以加热或在常温下进行，并优选在常温下进行。通常，碱液浸泡过程中需进行加热处理；而发明人发现，在常温下浸泡即可将水蛭粉中的成分充分溶出，从而避免进行加热产生的额外能耗，且操作更方便。
根据本发明的制备方法，步骤b中，采用弱酸将所述上清液调节ph至4～6。所述弱酸可以选自醋酸、乳酸、柠檬酸中的至少一种。现有的水蛭活性肽提取方法中，考虑到调节效率，这一步骤通常采用强酸调节ph值至酸性，所述强酸例如为盐酸、硫酸等，而较少考虑酸的性质对于产品的影响；发明人发现，强酸对于蛋白质成分破坏较大，对最终得到的水蛭活性肽产品活性产生不利影响。而采用弱酸调节ph，使蛋白质沉淀出来，减少了对蛋白质营养物质的破坏，且最终得到的水蛭活性肽产品活性更好。步骤b中，优选地，所述沉淀时间为8～12h，从而保证上清液中的蛋白质成分在上述ph下充分沉淀出来。优选地，沉淀工序完成后进行机械搅拌在搅拌下进行，从而使液体均匀，便于离心。
根据本发明的制备方法，步骤c中，采用加热方法使蛋白质变性。在所述的加热条件下即能够实现水蛭中的蛋白质成分完全变性，且有利于后续步骤中进行充分酶解，同时且避免了化学试剂对产品的污染。在加热变形后进行均质，进一步提高了酶解效率。
根据本发明的制备方法，步骤d中，将所述混悬液调节至ph5～9，优选为ph7～9，更优选为ph7～8。本发明中，将ph调节至上述弱碱性，更有利于本发明的酶制剂进行酶解。本发明中，酶制剂由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量比为3～5∶1～2组成。根据本发明优选的实施方式，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量比为3.3～4.5∶1.5～1.8。根据本发明一个优选的实施方式，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量比为3.5∶1.5。本发明的酶解过程一次性加入上述酶制剂，并在上述ph条件下进行酶解，能够得到更佳酶解效果。本发明的酶制剂对于水蛭中的蛋白质成分的酶解效率高，明显高于每种酶单用，且高于现有的水蛭活性肽用酶。当胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量比为3.5∶1.5时，酶解效率最高。根据本发明的制备方法，所述酶制剂的加入量可以为所述混悬液中固形物重量的0.5～4wt％，优选为0.7～3.5wt％，更优选为1.2～2.0wt％。本发明中，酶解温度为40～60℃，酶解时间为2～7h；优选地，酶解温度为45～60℃，酶解时间为2～6h。在上述酶制剂的加入量、酶解时间和温度下，水蛭蛋白可实现有效酶解。
根据本发明的制备方法，步骤e中，所述灭酶处理的温度为90～120℃，时间为0.5～3h。步骤e中，灭酶处理后的酶解液可以采用常规方法制成水蛭活性肽粉。
根据本发明另一优选的实施方式，将所述灭酶处理后的酶解液进行离心，离心液首先经板框压滤机过滤，再经陶瓷膜过滤，得到活性肽透过液；将所述活性肽滤液浓缩，喷雾干燥，从而得到水蛭活性肽粉。
本发明中，所述板框压滤机内含有组合过滤助剂，所述组合过滤助剂由活性炭、珍珠岩和硅藻土组成，且活性炭、珍珠岩和硅藻土的重量比5～6∶1～2∶1～2。根据本发明的一个优选的实施方式，所述组合过滤助剂中活性炭、珍珠岩和硅藻土的重量比5.5∶1.5∶2。根据本发明的另一个优选的实施方式，所述组合过滤助剂中活性炭、珍珠岩和硅藻土的重量比5.7∶1.8∶2。本发明的过滤助剂能够有效除去苦味。本发明中，所述陶瓷膜的孔径可以为20～500nm，更优选为20～300mm。采用这样的陶瓷膜孔径，能够实现酶解液的进一步精制。
经过本发明的过滤处理后，得到的水蛭活性肽粉中肽含量≥90wt％。
通常，肽的喷雾干燥操作在120～140℃进行，一般认为这样的干燥温度对于肽的活性影响不大。然而，发明人发现，现有的喷雾干燥的温度明显影响肽的活性。而本发明中，优选地，所述喷雾干燥操作在80～105℃进行，从而有效保持水蛭活性肽的热敏活性物质。
<含水蛭活性肽的组合物及其制备方法>
本发明的含水蛭活性肽的组合物可以由包括水蛭活性肽70～90重量份、余甘子5～15重量份和桑叶5～15重量份的原料制成。
根据本发明的一个实施方式，所述含水蛭活性肽的组合物由水蛭活性肽70～90重量份、余甘子5～15重量份和桑叶5～15重量份的原料制成。
本发明中，水蛭活性肽可以采用本发明的上述制备方法制备得到。水蛭活性肽溶解性和消化利用率高，无依赖性，可有效提高人体内白细胞水平，从而提高人体免疫功能，延缓人体机能衰老。余甘子具有抗炎，抗氧化，抗衰老，保肝等作用。桑叶具有桑叶酚，是抗溃疡的活性成分。本发明的水蛭活性肽配合少量余甘子与桑叶，预防消化性溃疡、调节血脂、防治贫血有辅助作用。
本发明的含水蛭活性肽的组合物的制备方法，可以采用多种不同比例的物料配比得到。
根据本发明的一个实施方式，所述组合物的制备方法为：(1)制备水蛭活性肽粉；(2)将余甘子和桑叶用水作为溶剂提取，提取液浓缩，干燥，粉碎，得到药材提取物；(3)将所述水蛭活性肽粉和药材提取物混合，得到本发明的组合物。其中，步骤(1)采用上述“水蛭活性肽的制备方法”制得，这里不再赘述。
以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明的保护范围不受此限制。
实施例1
水蛭活性肽的制备方法，包括以下步骤：
a、将水蛭进行超微粉碎，过400目筛，得到水蛭粉；将水蛭粉加入水蛭粉重量4倍量的水，混合，用氢氧化钠溶液调节至ph8，浸泡20h；机械搅拌，离心，取上清液；
b、将所述上清液用醋酸溶液调节至ph5，沉淀蛋白质，机械搅拌，离心，取固体部分；
c、将所述固体部分加入水，于95℃下加热20min，然后进行均质，得到混悬液；
d、将所述混悬液调节ph至8，加入酶制剂进行酶解，得到酶解液；该酶制剂由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶按照重量比3.5∶1.5组成；酶制剂的用量为混悬液中固形物重量的1wt％；酶解温度为50℃，酶解时间为2.5h；
e、将该酶解液进行灭酶处理，灭酶温度为95℃，时间为1.5h；将灭酶后的酶解液离心，离心液经板框压滤机过滤，板框压滤机内含有过滤助剂，过滤助剂由活性炭、珍珠岩和硅藻土按照重量比5.7∶1.8∶2组成；再经孔径为400nm的陶瓷膜过滤，得到活性肽透过液；将该活性肽透过液浓缩，在中低温喷雾干燥塔内于85℃喷雾干燥，得到水蛭活性肽粉。
实施例2
水蛭活性肽的制备方法，包括以下步骤：
a、将水蛭进行超微粉碎，过350目筛，得到水蛭粉；将水蛭粉加入水蛭粉重量3.5倍量的水，混合，用氢氧化钠溶液调节至ph9，浸泡22h；机械搅拌，离心，取上清液；
b、将所述上清液用醋酸溶液调节至ph6，沉淀蛋白质，机械搅拌，离心，取固体部分；
c、将所述固体部分加入水，于90℃下加热25min，然后进行均质，得到混悬液；
d、将所述混悬液调节ph至7.5，加入酶制剂进行酶解，得到酶解液；该酶制剂由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶按照重量比3.6∶1.7组成；酶制剂的用量为混悬液中固形物重量的1.2wt％；酶解温度为50℃，酶解时间为3h；
e、将该酶解液进行灭酶处理，灭酶温度为95℃，时间为1.5h；将灭酶后的酶解液离心，离心液经板框压滤机过滤，板框压滤机内含有过滤助剂，过滤助剂由活性炭、珍珠岩和硅藻土按照重量比5.5∶1.8∶1.5组成；再经孔径为400nm的陶瓷膜过滤，得到活性肽透过液；将该活性肽透过液浓缩，在中低温喷雾干燥塔内于85℃喷雾干燥，得到水蛭活性肽粉。
实施例3
除了将实施例1中步骤e不进行过滤操作，而是将步骤e的灭酶后的酶解液直接进行浓缩，在中低温喷雾干燥塔内于85℃喷雾干燥，得到水蛭活性肽，其他步骤与实施例1相同。
实施例4
将余甘子8重量份和桑叶8重量份混合，加入水作为溶剂加热回流提取3次，每次加水量依次为余甘子和桑叶总重量的8倍量、6倍量、6倍量，每次提取时间依次为1.5小时、1.5小时、1小时，提取液浓缩，干燥，粉碎，得到药材提取物。将实施例1的水蛭活性肽粉84重量份和上述药材提取物混合均匀，得到含水蛭活性肽的组合物。
对比例1
除了将实施例1中步骤d的酶制剂替换为由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶按照1∶3组成，其他步骤与实施例1相同。
对比例2
除了将实施例1的步骤b的醋酸溶液替换为盐酸溶液，其他步骤与实施例1相同。
对比例3
除了将实施例1的步骤e的过滤助剂替换为同等重量的活性炭，其他步骤与实施例1相同。
对比例4
除了将实施例1的步骤e的过滤助剂替换为同等重量的珍珠岩，其他步骤与实施例1相同。
对比例5
除了将实施例1中步骤e的过滤助剂替换为同等重量的硅藻土，其他步骤与实施例1相同。
对比例6
除了将实施例1的步骤e的喷雾干燥温度设置为135℃，其他步骤与实施例1相同。
测定实施例1～3和对比例1～6的水蛭活性肽中肽含量以及活性肽的味道，结果见表1。
肽的含量测定方法为：根据gb/t22492大豆肽粉中肽含量的测定方法进行。
苦味评价方法为：取1g水蛭活性肽加入10ml温水中搅拌均匀，将稀释倍数计为苦味值，计算20人的平均苦味值。
表1
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。