一种利用热解糖高温厌氧菌和丙酮丁醇梭菌共培养发酵生产丁醇的方法与流程

本发明属于微生物发酵领域，涉及丁醇发酵，具体涉及一种利用热解糖高温厌氧菌和丙酮丁醇梭菌共培养发酵生产丁醇的方法。

背景技术：

作为燃料，丁醇具有能量密度大、对水的稳定性高、可直接用于内燃机、运输方便等优点，在能源危机日益严峻的今天，丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。丁醇的生产方法主要有乙醛缩合法、丙烯羰基合成法和发酵法等。随着石油价格飞涨和资源加速枯竭，发酵法生产丁醇受到了广泛的重视，逐渐成为生物能源的研究热点之一。

传统的发酵法生产丁醇主要以粮食或其它淀粉质农副产品为原料，经水解得到发酵液，然后在发酵菌的作用下得到丁醇，菌株大都为溶剂梭菌，如拜式梭菌、丙酮丁醇梭菌等。由于其不能利用木质纤维素为碳源，其生产成本大大提高，不利于工业生产。谷物秸秆中的主要成分为纤维素和半纤维素，其中半纤维素的主要组分为木聚糖，能以木聚糖为唯一碳源生产丁醇可以大大降低生产成本，并且还可以变废为宝。

嗜热厌氧杆菌是目前报道的唯一可以通过一体化生物加工工程直接利用半纤维素生产生物丁醇的嗜热型野生菌株，但是其丁醇产量较低，报道产量一般低于0.1g/l。cn106995790a公开了一株能够直接利用木质纤维素为碳源生产丁醇的热解糖高温厌氧菌株m5(thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)，丁醇产量最高为1.32g/l，但其丁醇产量仍处于较低水平。而溶剂梭菌如丙酮丁醇梭菌是传统的产溶剂梭菌，为革兰氏阳性菌，呈两端圆形短杆状，有鞭毛，可运动，其丁醇产量较高，一般可达到10g/l左右，但是其只能利用单糖作为碳源，如葡萄糖，木糖等，成本较高，大大影响了其工业生产。目前对利用木质纤维素为原料进行共培养的报道较少。

技术实现要素：

发明目的：为了解决传统丁醇发酵方法以粮食或其他淀粉质副产品为原料生产成本过高的问题，本发明提供了一种利用热解糖高温厌氧菌和丙酮丁醇梭菌共培养发酵生产丁醇的方法。

技术方案：本发明所述一种利用热解糖高温厌氧菌和丙酮丁醇梭菌共培养发酵生产丁醇的方法，包括以下步骤：

(1)将活化的热解糖高温厌氧菌接种到含有木聚糖的发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；

(2)将活化的丙酮丁醇梭菌接种到步骤(1)得到的发酵液中，发酵生产丁醇。

步骤(1)所述发酵液中木聚糖酶的酶活达到0.3-0.8u/ml时，将活化的丙酮丁醇梭菌接种到步骤(1)得到的发酵液中。此时发酵液中有一定量木糖，且木聚糖酶和木二糖酶的活性最高，能够连续降解木聚糖为木糖，而丙酮丁醇梭菌可以利用降解得到的木糖生产丁醇。接种时间过早，木聚糖酶的酶活较低，不利用后续木聚糖的降解；接种时间过晚，则会导致菌株m5培养时间过长，木聚糖酶和木二糖酶分泌量减少，而先前分泌出的酶在55℃下的酶活下降，从而导致酶系的酶活下降，且部分降解得到的木糖也被菌株m5利用，从而减少了丙酮丁醇梭菌的碳流量，最终导致丁醇产量降低。因此，丙酮丁醇梭菌的接种时间是共培养发酵丁极为关键的步骤。

优选地，步骤(1)所述发酵液中木聚糖酶的酶活达到0.5-0.6u/ml时，将活化的丙酮丁醇梭菌接种到步骤(1)得到的发酵液中发酵生产丁醇。

步骤(1)所述活化的热解糖高温厌氧菌的接种量为发酵培养基体积的1-10％；所述含有木聚糖的发酵培养基配方为：0.5-2.0g/lnacl，0.5-2.0g/lk2hpo4，0.5-2.0g/lkh2po4，1.0-5.0g/l酵母粉，0.2-1.0g/lmgcl2·6h2o，0.1-0.6g/lnh4cl，0.01-0.05g/lcacl2·2h2o，0.5-2.0g/lfecl2·4h2o，0.1-0.5g/lkcl，木聚糖30-90g/l，溶剂为水，调节ph至6.0-6.5，通氮气10-20min，121℃灭菌15min；所述发酵条件为：发酵温度50-65℃，发酵时间为36-72h，发酵ph为5.5-8.5(每隔12-24h调节ph)，转速0-120rpm，可静置发酵，也可搅拌发酵。

优选地，所述含有木聚糖的发酵培养基中木聚糖浓度为60g/l。

优选地，步骤(1)所述发酵条件为：发酵温度55℃，发酵时间60h，发酵ph为7.5，转速120rpm。

所述热解糖高温厌氧菌的活化培养基配方为0.5-2.0g/lnacl，0.5-2.0g/lk2hpo4，0.5-2.0g/lkh2po4，1.0-5.0g/l酵母粉，0.2-1.0g/lmgcl2·6h2o，0.1-0.6g/lnh4cl，0.01-0.05g/lcacl2·2h2o，0.5-2.0g/lfecl2·4h2o，0.1-0.5g/lkcl，木聚糖30-90g/l，溶剂为水，调节ph至6.0-6.5；活化条件为：将热解糖高温厌氧菌以接种量5％v/v接种到活化培养基中，50-65℃、0-120rpm活化48-96h，每隔12h调节ph至5.5-8.5。

其中，热解糖高温厌氧菌(thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)，菌株号为m5，已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年2月27日，保藏号为cctccno:m2017072，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，已公开于中国申请专利cn106995790a中。热解糖高温厌氧菌m5可以通过木聚糖酶降解木聚糖得到木糖，并在木糖异构酶和木酮糖激酶的作用下得到3-p-甘油醛，从而进入三羧酸循环，得到丙酮酸，在经过一系列酶的催化最终可以得到乙酸、乙醇、丁酸、丁醇等产物。并且这些酶都具有较强的温度耐受性，对工业生产具有很高的价值。菌株m5具备从木糖到丁醇的全部基因，且其本身无丙酮的产生，是迄今为止报道的唯一能直接利用木聚糖生产丁醇且无丙酮生成的野生菌株，但其丁醇产量较低，经过培养基等优化，最高丁醇产量仅有1.32g/l，仍处于较低水平。除此之外，菌株m5可以在50-65℃下生长，其分泌出的从木聚糖到生产丁醇的酶均具有较高的温度稳定性。所述丙酮丁醇梭菌分类命名为丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)，菌株号为atcc824。

步骤(2)所述活化的丙酮丁醇梭菌的接种方式如下：将活化的丙酮丁醇梭菌培养液离心，将离心得到的沉淀接种到步骤(1)得到的发酵液中，其中活化的丙酮丁醇梭菌培养液与步骤(1)得到的发酵液体积相同；所述发酵条件为：发酵温度35-39℃，发酵时间为60-168h，发酵ph为4.5-7.0，转速为100-200rpm。

优选地，步骤(2)所述发酵条件为：发酵温度37℃，发酵时间为120h，发酵ph为5.5，转速为150rpm。

所述丙酮丁醇梭菌的活化培养基配方为0.5-2.0g/lnacl，0.5-2.0g/lk2hpo4，0.5-2.0g/lkh2po4，1.0-5.0g/l酵母粉，0.2-1.0g/lmgcl2·6h2o，0.1-0.6g/lnh4cl，0.01-0.05g/lcacl2·2h2o，0.5-2.0g/lfecl2·4h2o，0.1-0.5g/lkcl，木糖30-90g/l，溶剂为水；活化条件如下：将丙酮丁醇梭菌以接种量5％v/v接种到活化培养基中，37℃、150rpm活化48-96h，每隔12h调节ph至4.5-7.0，得到活化的丙酮丁醇梭菌培养液。

有益效果：与现有技术相比，本发明的技术优势如下：

(1)本发明通过先培养可以利用木聚糖为唯一碳源生长的热解糖高温厌氧菌m5，在高温厌氧的情况下将木聚糖降解为木糖，但由于其生产得到的丁醇产量低，故利用丁醇产量较高但不能直接利用半纤维素的丙酮丁醇梭菌进行共培养，以提高丁醇产量；

(2)当热解糖高温厌氧菌m5培养了60h时加入丙酮丁醇梭菌菌泥，丁醇产量最高，达到8.34g/l，这也是目前利用木聚糖为唯一碳源时共培养得到的最高丁醇产量。m5培养60h时，此时发酵液中木聚糖酶的酶活最高，木聚糖酶有效地降解了木聚糖，并得到18g/l的木糖；此后，在共培养体系中，木聚糖酶和木二糖酶仍具有较高的酶活，能够源源不断降解木聚糖为木糖，而丙酮丁醇梭菌可以利用降解得到的木糖生产丁醇，实现同步糖化发酵；

(3)该方法降低了工业生产丁醇的成本，同时解决了热解糖高温厌氧菌能利用半纤维素却丁醇产量低的问题，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为优化共培养发酵条件下发酵液中木糖浓度及木聚糖酶的酶活变化图；

图2为优化共培养发酵条件下发酵液中产物浓度变化图。

具体实施方式

实施例1以木糖为碳源利用丙酮丁醇梭菌clostridiumacetobutylicumatcc824产丁醇

从平板上挑取菌株丙酮丁醇梭菌clostridiumacetobutylicumatcc824单菌落接种到5ml发酵培养基中，37℃、150rpm培养48h，然后以接种量5％v/v接种到新的发酵培养基中，37℃、150rpm震荡培养，每隔12h调节ph至5.5，120h后用gc测其各种产物的浓度，最终丁醇产量为8.97g/l。

上述发酵培养基配方为1g/lnacl，0.75g/lk2hpo4，0.75g/lkh2po4，3g/l酵母粉，0.5g/lmgcl2·6h2o，0.3g/lnh4cl，0.015g/lcacl2·2h2o，1.5g/lfecl2·4h2o，0.3g/lkcl，木糖60g/l，调节ph至5.5，通氮气10-20min，121℃灭菌15min。

实施例2不同木聚糖浓度对最终丁醇产量的影响

(1)将热解糖高温厌氧菌以接种量5％v/v接种到活化培养基中，55℃、120rpm活化60h，每隔12h调节ph至7.5；

活化培养基配方为：1g/lnacl，0.75g/lk2hpo4，0.75g/lkh2po4，3g/l酵母粉，0.5g/lmgcl2·6h2o，0.3g/lnh4cl，0.015g/lcacl2·2h2o，1.5g/lfecl2·4h2o，0.3g/lkcl，木聚糖60g/l，溶剂为水，调节ph至7.5；

(2)将活化的热解糖高温厌氧菌m5以接种量5％v/v接种到发酵培养基中，55℃、120rpm发酵60h，每隔12h调节ph至7.5，得到发酵液；

发酵培养基配方为：1g/lnacl，0.75g/lk2hpo4，0.75g/lkh2po4，3g/l酵母粉，0.5g/lmgcl2·6h2o,0.3g/lnh4cl,0.3g/lkcl,0.015g/lcacl2·2h2o，1.5g/lfecl2·4h2o，溶剂为水，ph7.5，通氮气10～20min，121℃灭菌15min；设置三组发酵培养基，其中木聚糖浓度分别为30g/l，60g/l，90g/l；

(3)将丙酮丁醇梭菌以接种量5％v/v接种到丙酮丁醇梭菌的活化培养基中，37℃、150rpm活化60h，每隔12h调节ph至5.5；

活化培养基配方为：1g/lnacl，0.75g/lk2hpo4，0.75g/lkh2po4，3g/l酵母粉，0.5g/lmgcl2·6h2o，0.3g/lnh4cl，0.015g/lcacl2·2h2o，1.5g/lfecl2·4h2o，0.3g/lkcl，木糖60g/l，溶剂为水，调节ph至5.5；

(4)将活化好的丙酮丁醇梭菌以10％v/v接种到步骤(2)得到的发酵液中，37℃、，150rpm发酵132h，每隔12h调节ph至5.5。

培养过程中，每隔12h取样测定其丁醇产量。当木聚糖浓度为60g/l时，共培养得到的丁醇浓度最高，达到了2.61g/l；当木聚糖浓度为30g/l时，共培养得到的丁醇浓度仅有1.53g/l；当90g/l木聚糖浓度时的丁醇浓度也略低于60g/l木聚糖，为2.37g/l。

实施例3丙酮丁醇梭菌clostridiumacetobutylicumatcc824不同接种方法对丁醇产量的影响

方法同实施例2，不同的是发酵培养基中木聚糖的浓度为60g/l，步骤(3)活化好的丙酮丁醇梭菌培养液放入4℃离心机离心，转速为6000rpm、10min，然后将上清倒掉，将菌泥加入步骤(2)的发酵液中，其中活化好的丙酮丁醇梭菌培养液的体积与发酵液的体积相同；然后37℃继续培养，转速150rpm，每隔12h调节ph至5.5，发酵132h；

培养过程中，每隔12h取样并测定其丁醇产量。当以实施例2的接种方式共培养时，丁醇产量仅有2.61g/l；当以本实施例的接种方式共培养时，丁醇产量达到了8.34g/l；故采用本实施例的接种方式更优。

实施例4丙酮丁醇梭菌不同的接种时间对最终丁醇产量的影响

方法同实施例3，不同的是步骤(2)中设置4组实验，发酵时间分别为36h，60h,，84h，108h。

培养过程中，每隔12h取样并测定其丁醇产量。当热解糖高温厌氧菌m5培养了60h时加入丙酮丁醇梭菌菌泥，丁醇产量最高，达到8.34g/l，这也是目前利用木聚糖为唯一碳源时共培养得到的最高丁醇产量，见图1、图2。在此体系中，菌株m5分泌的木聚糖酶有效地降解了木聚糖，并得到约18g/l的木糖，此后，在共培养体系中，木聚糖酶和木二糖酶仍具有较高的酶活，能够源源不断降解木聚糖为木糖，而丙酮丁醇梭菌可以利用降解得到的木糖生产丁醇。接种时间过早，木聚糖酶活较低，不利用后续木聚糖的降解，而接种过晚，则会导致菌株m5培养时间过长，木聚糖酶和木二糖酶分泌量减少，而先前分泌出的酶在55℃下的酶活下降，从而导致酶系的酶活下降，且部分降解得到的木糖也被菌株m5利用，从而减少了丙酮丁醇梭菌的碳流量，最终导致丁醇产量降低。