一种快速培养金黄色葡萄球菌的大米蛋白胨的制备的制作方法

本发明涉及一种快速培养金黄色葡萄球菌的大米蛋白胨的制备，属于酶制剂技术领域。

背景技术：

在原有的蛋白胨种类中添加新的蛋白胨，为不同的培养基原料提供特定的蛋白胨，大米蛋白是植物蛋白，与大豆蛋白有很多相似的价值，即可以有大豆胨的相同价值，也可以将品质差的米加以利用，通过研究酶解工艺，控制酶解条件，使得产物的氮源成分品质最佳，利于金黄色葡萄球菌的生长。并且氮源存在于多种培养基中，如普通培养基、检测培养基和发酵培养基等，大米蛋白胨不仅可以作为培养基的成分之一，也可以与其它蛋白胨复配提高原有蛋白胨的应用价值，在相关行业有重要的学术和应用意义。

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)是兼性厌氧的革兰氏阳性菌，是医院获得性感染中最常见和食源性疾病的病原体之一。金黄色葡萄球菌毒素和毒力蛋白酶通常在宿主血管中循环导致危及生命的疾病，病原体通常在开放性伤口和尿道中生长，从轻微的皮肤感染到危及生命的疾病如脓肿，肺炎，脑膜炎，心内膜炎和败血病。金黄色葡萄球菌可以生活在恶劣的环境中，容易污染冷冻食品、水等物品，在每个国家，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占的比例较大，成为世界性的公共卫生问题。因此，尽可能缩短检测时间，尽早检测和鉴定出金黄色葡萄球菌，对于公共卫生和食品安全的监测和控制具有重要的意义。现有的检测方法通常将培养的金黄色葡萄球菌进行富集培养以便于准确的定性和定量分析。

技术实现要素：

为解决现有技术检测周期长的问题，本发明的第一个目的是提供一种用于快速培养金黄色葡萄球菌或大肠埃希菌的大米蛋白胨，是向含有大米蛋白的溶液中同时加入碱性蛋白酶、氨肽酶和中性蛋白酶进行酶解，以酶解后的溶液进行冻干为粉末状作为培养基成分对金黄色葡萄球菌或大肠埃希菌进行培养。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基中还含有nacl、牛肉浸膏。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基中，大米蛋白胨、nacl和牛肉浸膏的含量为：10g/l、5g/l、3g/l。

在本发明的一种实施方式中，所述酶解是按4000～8000u/g大米蛋白的加酶量加入碱性蛋白酶；按100～500u/g大米蛋白的加酶量加入氨肽酶；按3000～4000u/g大米蛋白的加酶量加入中性蛋白酶。

在本发明的一种实施方式中，所述酶解是对浓度为60～120g/l大米蛋白溶液进行酶解。

本发明的一种实施方式中，所述碱性蛋白酶添加量为4000～8000u/g大米蛋白。

本发明的一种实施方式中，所述氨肽酶添加量为100～500u/g大米蛋白。

本发明的一种实施方式中，所述中性蛋白酶添加量3000～4000u/g大米蛋白。

本发明的一种实施方式中，所述酶解是在35℃～40℃下进行。

本发明的一种实施方式中，所述酶解时间为1～6h。

本发明的一种实施方式中，所述酶解ph为6.5～8.0。

本发明的一种实施方式中，所述培养金黄色葡萄球菌在培养前经过活化，所述活化培养基lb成分为：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l。

在本发明的一种实施方式中，所述培养是在36～38℃培养24～29h。

在本发明的一种实施方式中，所述大米蛋白的浓度为80g/l，碱性蛋白酶添加量8000u/g底物，氨肽酶添加量500u/g底物，中性蛋白酶添加量3000u/g底物，反应温度35℃，ph7.5，反应时间2h。

本发明的第二个目的是提供一种新的蛋白胨，经过碱性蛋白酶、氨肽酶和蛋白酶酶解处理。

在本发明的一种实施方式中，所述酶解是按4000～8000u/g大米蛋白的加酶量加入碱性蛋白酶；按100～500u/g大米蛋白的加酶量加入氨肽酶；按3000～4000u/g大米蛋白的加酶量加入中性蛋白酶。

本发明的一种实施方式中，所述酶解是在35℃～40℃下进行。

本发明的一种实施方式中，所述酶解时间为1～6h。

本发明的一种实施方式中，所述酶解ph为6.5～8.0。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基中还含有nacl、牛肉浸膏。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基中，蛋白胨、nacl和牛肉浸膏的含量为：10g/l、5g/l、3g/l。

本发明的第三个目的是提供一种大米蛋白胨与其它种类蛋白胨的复配。

在本发明的一种实施方式中，将大米蛋白胨与自制的胰蛋白胨进行不同质量比的复配为：1:2～1:5(胰蛋白胨的质量：大米蛋白的质量)和1:1～5:1(胰蛋白胨的质量：大米蛋白的质量)。

在本发明的一种实施方式中，将大米蛋白胨与市场上销售的国产蛋白胨、鱼蛋白胨、进口蛋白胨和胰蛋白胨以质量比为1:3进行复配。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基中还含有nacl、牛肉浸膏。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基中，复合蛋白胨、nacl和牛肉浸膏的含量为：10g/l、5g/l、3g/l。

本发明还提供所述蛋白胨在食品、医药领域食源性致病菌检测、微生物培养方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括制备大米蛋白胨、大米蛋白胨的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明提供了一种快速培养金黄色葡萄球菌的大米蛋白胨的酶解优化策略，从而促进金黄色葡萄球菌的生长。经过酶解处理的大米蛋白，肽主要是小于3000da，并且占全部肽的99.28％，从而得到蛋白胨主要由3000～200da的多肽分子混合而成的。大米蛋白酶解液中的氨基酸不仅种类多，而且必须氨基酸占总氨基酸的58.48％，非必需氨基酸占41.52％，使得微生物在生长代谢中能够充分的利用所需的氨基酸进行生长繁殖。在众多的氨基酸中支链氨基酸缬氨酸(val)、异亮氨酸(ile)和亮氨酸(leu)的总含量为32.56％，而芳香族氨基酸色氨酸(trp)、苯丙氨酸(phe)和酪氨酸(tyr)总含量为20.07％，支链氨基酸的偏多有利于促进金黄色葡萄球菌的快速生长繁殖。

2、应用本发明的大米蛋白胨不仅能培养金黄色葡萄球菌也能培养多种其他微生物。

3、应用本发明的大米蛋白胨与市场上销售的蛋白胨以1:3的质量进行复配，有利于提升单一蛋白胨的应用价值。

附图说明

图1为酶解大米蛋白流程示意图；

图2为不同酶解时间和不同酶的产物对金黄色葡萄球菌生长的影响；

图3为碱性蛋白酶的不同加酶量的产物对金黄色葡萄球菌生长的影响；

图4为氨肽酶的不同加酶量的产物对金黄色葡萄球菌生长的影响；

图5为中性蛋白酶的不同加酶量的产物对金黄色葡萄球菌生长的影响；

图6为不同ph的酶解产物对金黄色葡萄球菌生长的影响

图7为不同酶解温度的产物对金黄色葡萄球菌生长的影响；

图8为不同底物浓度的酶解产物对金黄色葡萄球菌生长的作用；

图9为不同蛋白胨培养金黄色葡萄球菌的生长曲线；

图10为不同蛋白胨培养大肠埃希菌的生长曲线；

图11为不同蛋白胨培养枯草芽孢杆菌的生长曲线；

图12为大米蛋白胨与自制胰蛋白胨不同质量复配对金黄色葡萄球菌生长的作用；

图13为大米蛋白胨与市场上销售的蛋白胨以1:3的质量复配对金黄色葡萄球菌的作用。

具体实施方式

实施例1

(1)酶解大米蛋白：配制浓度为60～120g/l的大米蛋白溶液，碱性蛋白酶加酶量为4000～8000u/g大米蛋白；氨肽酶加酶量100～500u/g大米蛋白，中性蛋白酶加酶量为3000～4000u/g大米蛋白，反应温度35℃，ph7.5，反应时间2h。将反应后的酶解液冻干处理，获得大米蛋白胨。

(2)冻干程序如下表1所示：

将酶解后的液体离心保留上清液，将上清液分装到50ml的离心管中，放入-20℃冰箱中预冻12h后，再将其放入-80℃冰箱预冻12h。将其放入真空冷冻干燥机的托盘中，按照表1中的程序进行冻干。

(3)配制营养肉汤液体培养基：1000ml超纯水，本实施例制备的蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，nacl5g。

(4)商业化的金黄色葡萄球菌在lb培养基中进行活化，活化好的金黄色葡萄球菌在lb液体培养基中培养16-18小时，取菌液用灭菌的去离子水稀释10⁴倍，从中取100μl稀释液到上述组成的液体培养基，37℃，220r/min摇床培养，培养24h或28h，分别在各摇瓶中取2ml菌液，以相对应的不加菌液的培养基为空白对照，用分光光度计在波长为600nm条件下测od值。od值越高，说明此条件下的酶解条件获得的大米蛋白胨对金黄色葡萄球菌的促进作用更明显。

实施例2

按实施例1相同的步骤进行操作，区别在于，分别用碱性蛋白酶与胰蛋白酶酶解，时间分别为1、2、3、4、5、6h，两者加酶量都为12000u·g^-1。

结果如图2所示：

碱性蛋白酶酶酶解大米大白随着时间的变化，培养的金黄色葡萄球菌的od值先增后减再增的趋势，当酶解时间为2h时，它为最大值。

胰酶酶解大米蛋白时，随着时间的变化，od值处于一个持续上升的状态，酶解时间在2至3h，和4至6h时，这两阶段的od值分别变化不大，当时间为4h后，od值基本一致，这可能是底物已经酶解充分，成分不再随着酶解时间的延长而发生改变，用此时段的产物培养菌株的效果变得几乎一致。

大米蛋白在酶解前2h时，碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解的产物对菌株的效果，趋势一致，逐渐上升，前者对金黄色葡萄球菌生长的作用更加有利。但2h以后，碱性蛋白酶的对菌株的生长效果呈现一个v形变化，而胰蛋白酶对生长的影响呈现一个阶梯型，并且碱性蛋白酶的作用都高于胰蛋白酶的酶解产物。综合考虑，选择碱性蛋白酶作为酶解所用酶之一，时间选择2h。

实施例3

按实施例1相同的步骤进行操作，区别在于，只加入碱性蛋白酶，加酶量分别为4000u·g^-1、6000u·g^-1、8000u·g^-1、10000u·g^-1、12000u·g^-1、14000u·g^-1、16000u·g^-1，酶解2h，以底物浓度为10％，ph为8.5，温度为50℃。

结果如图3所示，不同的碱性蛋白酶酶解大米大白的产物培养金黄色葡萄球菌的生长效果不一致，当酶的添加量为小于8000u·g^-1时，随着酶量的加大，金黄色葡萄球菌的od值逐渐增大，说明此条件下酶解的产物对菌株生长的作用逐渐增大，当加酶量大于8000u·g^-1时，随着酶量的添加，od值逐渐变小，此时产物对菌株的促生长作用也随着酶量的增加而减小，当添加量为8000u·g^-1时，od值为最大，说明在该酶解条件下的产物，对其生长最有利。可能是此时的产物成分，便于菌株的吸收利用，以便于自身快速生长繁殖。所以选择8000u·g^-1作为碱性蛋白酶的酶解大米蛋白的加酶量。

实施例4

按实施例1相同的步骤进行操作，区别在于，碱性蛋白酶用量为8000u·g^-1，酶解时间为2h，氨肽酶的用量分别为100u·g^-1、200u·g^-1、300u·g^-1、400u·g^-1、500u·g^-1、600u·g^-1。

结果如图4所示，当添加量小于300u·g^-1时，培养的金黄色葡萄球菌的od值基本不变，当添加量为400u·g^-1时，od值为最小，当酶的添加量为500u·g^-1时，od值为最大，此添加量所获得的产物对菌株的生长最有利，可能是该条件下的成分对菌株的生长起到一个关键的作用。

实施例5

按实施例1相同的步骤进行操作，区别在于，碱性蛋白酶用量为8000u·g^-1，氨肽酶的用量为500u·g^-1，中性蛋白酶的用量分别为1000u·g^-1、2000u·g^-1、3000u·g^-1、4000u·g^-1、5000u·g^-1。

结果如图5所示，中性蛋白酶的加入，使得相对应的产物对金黄色葡萄球菌的生长作用更加有利，随着中性蛋白酶的增加，od值先增后减，当加酶量为3000u·g^-1时，od值为最大，综合考虑选择用量为3000u·g^-1。选择碱性蛋白酶、中性蛋白酶和氨肽酶同时复合酶解，使得大米蛋白的酶解产物有利于金黄色葡萄球菌的生长。

实施例6

按实施例1相同的步骤进行操作，区别在于，用5mol·l^-1和0.5mol·l^-1的氢氧化钠调节酶解时的ph为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0。

结果如图6所示，随着ph的增加，od值呈现一个下降的趋势，但当ph为7.5时，此时的od值为最大，当ph为9.0时，此条件下的酶解产物培养菌株所获得的od值最小，可能因为ph为9.0时，中性蛋白酶较适ph范围为6.0～8.0，中性蛋白酶的活性受到影响，酶解效果变弱，使得酶解大米蛋白获得的产物成分发生改变，偏离适合金黄色葡萄球菌生长的组分。

实施例7

按实施例1相同的步骤进行操作，区别在于，酶解温度分别为35℃、40℃、45℃、50℃和55℃。

结果如图7所示，当酶解温度低于45℃时，随着温度的增加，所对应的温度酶解的产物对金黄色葡萄球菌的生长促进作用逐渐下降，当温度高于45℃时，随着温度的升高，od值先增后减，说明相对应的条件下的产物被菌株利用的效率变低，使得生长变慢。当温度为35℃时，此条件下培养菌株获得的od值最大。所以选择35℃为接下来的酶解温度。

实施例8

按实施例1相同的步骤进行操作，区别在于，底物浓度分别为4％、6％、8％、10％和12％。结果如图8所示，随着底物浓度的增加，od值的大小在4％到8％之间，随着底物的增加而增加，当底物浓度在8％到12％之间时，od值随着底物浓度的增加而减小。当底物浓度为8％时，od值达到一个最大的值，说明此条件下的产物对金黄色葡萄球菌的生长最加有利。

实施例9

准确称取5.6g大米蛋白，配制成底物浓度为8％大米蛋白溶液70ml，利用恒温磁力搅拌器维持酶解温度为35℃，按碱性蛋白酶与底物的用量比为8000u/g，加入0.310ml酶粉(酶活力14.6万u/ml)于大米蛋白溶液中；按氨肽酶与底物的用量比为500u/g，加入0.611g酶粉(酶活力4580u/g)于大米蛋白溶液中；按中性蛋白酶与底物的用量比为3000u/g，加入0.1018g酶粉(酶活力16万u/g)于大米蛋白溶液中。滴加0.5mol/l的naoh调节ph，维持ph7.5，酶解2h，将酶解液12000rpm离心10min，取上清液2ml测酶解液的多肽分子量分布，取上清3ml加入等体积的10％的tca溶液，静置1h，10000rpm，离心10min，取上清过0.22μm的微滤膜，取400ul测酶解液的游离氨基酸含量和多肽分子量。

多肽分子量分布(表2)结果所示：经过酶解处理的肽主要是小于3000da，并且占全部肽的99.28％，从而得到蛋白胨主要由3000～200da的多肽分子混合而成的，主要依靠其促进金黄色葡萄球菌的生长。

表2大米蛋白胨的分子量

氨基酸分析(表3)大米蛋白酶解液中的氨基酸不仅种类多，而且必须氨基酸占总氨基酸的58.48％，非必需氨基酸占41.52％，使得微生物在生长代谢中能够充分的利用所需的氨基酸进行生长繁殖。在众多的氨基酸中支链氨基酸缬氨酸(val)、异亮氨酸(ile)和亮氨酸(leu)的总含量为32.56％，而芳香族氨基酸色氨酸(trp)、苯丙氨酸(phe)和酪氨酸(tyr)总含量为20.07％，支链氨基酸的偏多有利于促进金黄色葡萄球菌的快速生长繁殖。

表3氨基酸组成与含量

实施例10

大米蛋白胨可行性的分析。细菌生长曲线的测定，将大米蛋白肽按照营养培养基的成分配成培养基，并与市场上销售的2种蛋白胨及鱼蛋白胨对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢肝菌进行生长曲线的测定。活化好的细菌分别在lb培养基中培养16～18h，按照0.5％的接菌量吸取到相应的液体培养基中，37℃，220r/min摇床培养24h，其中每隔2h从摇瓶取一次样，测od600，考察大米蛋白胨对金黄色葡萄球菌的促生长作用和对其它微生物的可行性。

结果(图9～图11)表明：从图9中可以得到，4种原料培养金黄色葡萄球菌的生长趋势基本一致，延迟期都是6h左右，随着培养时间的不断变化，4种原料培养的菌株差距逐渐扩大，其中大米蛋白胨所培养的金黄色葡萄球菌的od值无论是对数期还是平稳期，都是最大值，并且差距非常的明显。可以得到其所存在的生物量也是最大的。说明大米蛋白胨对金黄色葡萄球菌的生长促进作用最为明显，其次为胰蛋白胨1，接着为胰蛋白胨2，2种胰蛋白胨对此微生物的效果也有差距，其中胰蛋白胨的效果好于胰蛋白胨1，说明不同的厂商生产的蛋白胨有差异。培养效果最差的为蛋白胨，说明鱼蛋白胨对金黄色葡萄球菌的生长作用促进作用最弱。

从图中10可以得到，大肠埃希菌的延迟期基本没有，适应性强，其中大米蛋白胨培养的生长曲线，无论是生长期还是稳定期所在的od值都高于另外3种，说明大米蛋白胨对大肠埃希菌的生长作用最有利，胰蛋白胨与鱼蛋白胨两者在对数期时，此微生物的od值基本一致，但稳定期时，胰蛋白胨1的培养效果好于鱼蛋白胨，鱼蛋白胨的od值与胰蛋白胨2的od值在对数期有差异，但随着培养时间的延长，两者差距缩小，最终趋于一致。

从图中11可以得到，4种原料对枯草芽孢杆菌的生长曲线各不一样，其中自高点出现的时间不一致，其中较为突出的是胰蛋白胨2，它的对数期与大米蛋白胨基本一致，但胰蛋白胨2培养此菌的稳定期比大米蛋白胨的长，后者基本没有稳定期。胰蛋白胨1培养枯草芽孢杆菌的od值在对数期的末端及稳定期都高于鱼蛋白胨，说明胰蛋白胨1的培养效果好于鱼蛋白胨。大米蛋白胨培养微生物的生长曲线与其它3种的不一样，没有稳定期，但有一个最高点，其最高点与胰蛋白胨2的基本接近，可以得到大米蛋白胨对此微生物的培养促进作用也比较有优势。

大米蛋白胨培养比较常用及检测的微生物，以及与市场上销售常用的胰蛋白胨和鱼蛋白胨，可以得到，大米大白胨对微生物生长促进作用的优势高于其它3种蛋白胨，尤其是在培养微生物金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌这两种微生物方面生长促进作用尤其明显，可以添加或替换成此大米蛋白胨用于培养检测病原菌金黄色葡萄球菌，无论是在食品卫生安全还是医疗微生物检测中起到缩短检测时间的目的。在生产方面可以使得在短时内达到理想的生物量。大米蛋白胨作为微生物的培养成分之一是可行的。

实施例11

将自制胰蛋白胨和大米蛋白胨按照质量比进行复配，按照以下配方：复配蛋白胨10g/l，牛肉浸粉3g/l，氯化钠5g/l，配制培养基。37℃，220r/min摇床培养培养。分别培养24h后，取样测od600值，结果如图12所示。横坐标代表每一组实验的蛋白胨分别按照胰蛋白胨：大米蛋白胨的质量分别为1:2、1:3、1:4、1:5、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、1:0和0:1，两种蛋白胨复配后培养金黄色葡萄球菌，其od值普遍比其中两种单一蛋白胨培养金黄色葡萄球菌的生长有利，及促生长作用。其中质量比1:2至1:5是大米蛋白胨的质量逐渐增加，od值呈现一个反比例，随着大米蛋白胨的增加而减小；其中1:1至5:1是大米蛋白胨质量逐渐减少，胰蛋白胨的质量逐渐增加，od值随着胰蛋白胨质量的增加，促生长作用也随着增加。根据复配比例得到，当胰蛋白胨比例高于大米蛋白胨时，促生长作用高于后者大于前者的比例。当胰蛋白胨与大米蛋白胨的质量比为3:1时，od值最大，说明对金黄色葡萄球菌的促生长作用最佳。

实施例12

将大米胨分别与国产蛋白胨、鱼蛋白胨、进口蛋白胨和胰蛋白胨以质量比为1:3进行复配后对金黄色葡萄球菌进行培养，并与其单独培养作对比。将金黄色葡萄球菌在lb培养基上活化，活化好的细菌分别在lb培养基中培养16～18h，将此时的菌液稀释10⁴后，从中取100ul到相应的液体培养基中，37℃，220r/min摇床培养24h，取样，测od600，结果如图13所示。当蛋白胨和大米蛋白胨复合使用时，od值为正方形所在线一组，当蛋白胨单独使用时，od值为圆形线所在一组，可以看出，复合蛋白胨的促菌生长作用都高于单一蛋白胨。说明大米蛋白胨可以用来提高蛋白胨对微生物的促进生长作用，可以作为复配成分之一，提高氮源成分差的蛋白胨，有利于增加蛋白胨种类的增加和效果提升。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。