一、技术领域
本发明属于生物领域，特别涉及青刀豆品种‘甬绿1号’、‘甬绿3号’和‘甬绿4号’真实性的一种鉴定方法。
二、
背景技术：
青刀豆(phaseolusvulgaris)，又名四季豆、芸豆和小刀豆，一年生缠绕性草本植物，豆荚营养丰富，富含蛋白质，既可直接上市鲜食，也可制成速冻蔬菜出口创汇，经济效益高。青刀豆是严格的自花授粉作物，品种以常规种为主，由于常规种没有亲本，可自行留种，因此市面上流通的青刀豆普遍出现来源不明、同物异名和同名异物等问题，为青刀豆新品种保护增大难度。青刀豆品种真实性的常规鉴定方法主要是利用籽粒、苗期或成株期形态学指标进行鉴别，这些表型指标易受植株发育时期和生长环境影响，鉴定周期长、鉴定结果准确性低。因此，建立一种鉴定青刀豆品种真实性的方法对维护生产者和育种者的利益迫在眉睫。
‘甬绿1号’、‘甬绿3号’和‘甬绿4号’是宁波市农业科学研究院自主选育的青刀豆新品种，具有耐热、高产、豆荚鲜绿等特色，推广后深受农户欢迎。目前‘甬绿1号’、‘甬绿3号’和‘甬绿4号’只作了大田形态学鉴定，尚缺乏便捷有效的品种真实性鉴定方法，对于品种保护还远远不够。
三、
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供一种利用dna指纹图谱鉴定青刀豆品种‘甬绿1号’、‘甬绿3号’和‘甬绿4号’品种真实性的方法。
为实现本发明的目的，发明者提供以下技术方案：采用ctab法提取‘甬绿1号’、‘甬绿3号’和‘甬绿4号’及其对照品种的幼叶dna；利用6对ssr引物和1个rapd引物进行pcr扩增(引物名称与序列表中序列号的对应关系如表1所示，引物具体序列见本说明书最后所附序列表)；扩增产物经琼脂糖电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。有差异的等位位点，扩增出条带的记为“1”，同一位置无带记为“0”；将这些差异扩增片段转换为由1和0组成的字符串，即构成dna指纹图谱，用以区分3份青刀豆品种及其对照。
本发明的优点：与常规形态鉴定比较，本发明的鉴定结果准确可靠、耗时短、不受环境影响、操作简单，可以同时鉴定多个品种，方便快捷。
四、附图说明
图1为本发明实施例中，ssr引物sd43/44、sd63/64、sd103/104、sd111/112、sd113/114、sd151/152和rapd引物p158在‘甬绿1号’、‘甬绿3号’和‘甬绿4号’及其对照材料‘鲜绿1号’和‘南太湖’中的扩增。
图1中左侧三幅图片自上而下分别是ssr引物sd43/44、sd63/64和sd103/104在‘甬绿1号’、‘甬绿3号’和‘甬绿4号’及其对照材料‘鲜绿1号’和‘南太湖’中的扩增；右侧四幅图片自上而下分别是ssr引物sd111/112、sd113/114、sd151/152和rapd引物p158在‘甬绿1号’、‘甬绿3号’和‘甬绿4号’及其对照材料‘鲜绿1号’和‘南太湖’中的扩增。两组图片样品排列顺序自左至右依次为dnamarker、‘甬绿1号’、‘甬绿3号’、‘甬绿4号’、‘鲜绿1号’和‘南太湖’。图片左侧标注是dnamarker标准分子量，右侧标注是引物名称及差异位点所在片段大小。
五、具体实施方式
1、取样：播种‘甬绿1号’、‘甬绿3号’和‘甬绿4号’及其对照，待植株长至5-6片真叶时，采集嫩叶1g，-80℃保存。
2、dna提取：参照ctab法(见：murrayhg，thompsonwf.rapidisolationofhigherweightdna.nucleicacidsres，1980，8：4321)，提取新鲜叶片总基因组dna。
3、pcr扩增：ssr和rapd的混样体系均为15μl(faziog，staubje，stevensmr.geneticmappingandqtlanalysisofhorticulturaltraitsincucumber(cucumissativusl.)usingrecombinantinbredlines.theorapplgenet，2003，107：864-874)，包括1.5μldntp(1.25mm)，1.5ul10×buffer，1.5ulmgcl2(25mm)，2.0ul引物(5mm；ssr两条引物分别添加1.0ul)，5uldna(10ng/ul)，0.05ultaq(1u)，3.45ul超纯水。ssr的pcr扩增程序为：预变性94℃1min；变性93℃1min，退火40℃1min，延伸72℃2min(40个循环)；延伸72℃1min。rapd的pcr扩增程序为：预变性94℃4min；变性93℃15sec，退火37℃1min30sec，延伸72℃2min(40个循环)；延伸72℃6min。
4、pcr产物检测：ssr使用2.5％高分辨率标准凝胶琼脂糖(dna片段分离范围40-1kbp)，rapd扩增产物使用2％普通标准凝胶琼脂糖(dna片段分离范围500-20kbp)。添加20μleb(ethidiumbromide，溴化乙锭)显色。在pcr产物中加入2μlloadingdye，电泳2-3小时，电压200-250v。电泳结束后，利用凝胶成像系统观察结果。
5、数据收集与分析：对6对ssr引物sd43/44、sd63/64、sd103/104、sd111/112、sd113/114、sd151/152和1个rapd引物p158在‘甬绿1号’、‘甬绿3号’和‘甬绿4号’及其对照材料‘鲜绿1号’和‘南太湖’中的扩增结果进行赋值，某等位基因扩增出条带的记为“1”，同一位点无扩增条带的记为“0”。将这些差异扩增片段转换为由1和0组成的字符串，即构成品种指纹图谱(表1)。利用7个分子标记产生的12个多态性位点，构建‘甬绿1号’的指纹图谱为1-0-0-0-1-0-1-0-0-1-0-1、‘甬绿3号’的指纹图谱为0-1-0-1-0-1-0-1-1-0-1-1、‘甬绿4号’的指纹图谱为0-1-0-0-0-1-0-0-0-1-1-1、‘鲜绿1号’的指纹图谱为1-0-0-0-1-0-1-0-0-1-0-0、‘南太湖’的指纹图谱为0-1-1-1-1-1-1-0-1-1-1-1。这些指纹图谱不仅可以有效区分上述三个品种，还可以将它们从形态易混淆的相似品种中甄别出来，起到品种鉴定与保护的作用。
表1供试瓠瓜类型砧木品种及对照编号、名称和rapd/ssr指纹图谱