一种CYP2C19基因分型检测的核酸组合及检测试剂盒和应用的制作方法

本发明涉及医学检验领域，具体而言，涉及一种cyp2c19基因分型检测的核酸组合及检测试剂盒和应用。
背景技术：
：氯吡格雷(波立维)作为口服抗血小板药物，广泛用于防治心肌梗死、缺血性脑血栓、血栓栓塞、动脉粥样硬化及闭塞性脉管炎等疾病。其本身为无作用的前体药物，口服后约85％的氯吡格雷被酯酶水解，只有15％的药物经肝脏的细胞色素p450酶系(cytochromep450，cyp)转化成为活性成分后发挥作用。cyp2c19是一种十分重要的药物代谢酶，主要存在于肝脏微粒体内，许多内源性底物、环境污染物以及临床上大约2％的药物都由其催化代谢。fda已经在波立维(氯吡格雷)的包装上增加了黑框警示，要求临床在使用波立维之前检测患者cyp2c19基因型。目前用于snp突变检测的方法包括：直接测序法、armspcr法、酶切(pcr-rlfr)法、dna芯片法、taqman-mgb探针分型法等。这些方法在推广上都或多或少存在如试剂检测成本高，操作复杂，易产生污染，产生一定假阴性和假阳性等缺陷。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种cyp2c19基因分型检测的核酸组合，该核酸组合能灵敏的、特异性的进行反应，对cyp2c19基因进行分型。本发明的第二目的在于提供上述的cyp2c19基因分型检测的核酸组合在cyp2c19基因分型检测中的应用，应用以非诊断或非治疗为目的。本发明的第三目的在于提供上述cyp2c19基因分型检测的核酸组合在制备cyp2c19基因分型检测的检测试剂盒中的应用。本发明的第四目的在于提供一种cyp2c19基因分型检测的检测试剂盒，该检测试剂盒能方便快捷地用于cyp2c19基因分型。本发明的第五目的在于提供上述的cyp2c19基因分型检测的检测试剂盒在cyp2c19基因分型检测中的应用，应用以非诊断或非治疗为目的。为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：一种cyp2c19基因分型检测的核酸组合，核酸组合包括检测引物组合和检测探针组合；检测引物组合包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对；第一引物对的碱基序列分别如seqidno.1-2所示，第二引物对的碱基序列分别如seqidno.3-4所示，第三引物对的碱基序列分别如seqidno.5-6所示，第四引物对的碱基序列分别如seqidno.7-8所示；检测探针组合包括第一野生型检测探针、第一突变型检测探针、第二野生型检测探针、第二突变型检测探针、第三野生型检测探针、第三突变型检测探针、第四野生型检测探针和第四突变型检测探针；第一野生型检测探针的碱基序列如seqidno.9所示，第一突变型检测探针的碱基序列如seqidno.10所示；第二野生型检测探针的碱基序列如seqidno.11所示，第二突变型检测探针的碱基序列如seqidno.12所示；第三野生型检测探针的碱基序列如seqidno.13所示，第三突变型检测探针的碱基序列如seqidno.14所示；第四野生型检测探针的碱基序列如seqidno.15所示，第四突变型检测探针的碱基序列如seqidno.16所示；第一野生型检测探针、第二野生型检测探针、第三野生型检测探针和第四野生型检测探针的5’端标记有第一荧光基团，3’端标记有第二荧光剂基团；第一突变型检测探针、第二突变型检测探针、第三突变型检测探针和第四突变型检测探针的5’端标记有第三荧光基团，3’端标记有第二荧光剂基团。上述的cyp2c19基因分型检测的核酸组合在cyp2c19基因分型检测中的应用，应用以非诊断或非治疗为目的。上述cyp2c19基因分型检测的核酸组合在制备cyp2c19基因分型检测的检测试剂盒中的应用。一种cyp2c19基因分型检测的检测试剂盒，cyp2c19基因分型检测试剂盒包括上述的cyp2c19基因分型检测的核酸组合。上述的cyp2c19基因分型检测的检测试剂盒在cyp2c19基因分型检测中的应用，应用以非诊断或非治疗为目的。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的cyp2c19基因分型检测的核酸组合能准确地、特异地参与反应，简略快速的完成分型实验检测，将cyp2c19基因分型检测的核酸组合应用到制备cyp2c19基因分型检测的检测试剂盒中，制得的检查试剂盒，能更方便的进行检测反应，快速的进行基因分型，具有较大的使用价值和社会价值。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明实验例1提供的野生型cyp2c19*2扩增反应曲线图；图2为本发明实验例1提供的突变型cyp2c19*2扩增反应曲线图；图3为本发明实验例1提供的混合型cyp2c19*2扩增反应曲线图；图4为本发明实验例1提供的野生型cyp2c19*3扩增反应曲线图；图5为本发明实验例1提供的突变型cyp2c19*3扩增反应曲线图；图6为本发明实验例1提供的混合型cyp2c19*3扩增反应曲线图；图7为本发明实验例1提供的野生型cyp2c19*17(c-806t)扩增反应曲线图；图8为本发明实验例1提供的突变型cyp2c19*17(c-806t)扩增反应曲线图；图9为本发明实验例1提供的混合型cyp2c19*17(c-806t)扩增反应曲线图；图10为本发明实验例1提供的野生型cyp2c19*17(c-3402t)扩增反应曲线图；图11为本发明实验例1提供的突变型cyp2c19*17(c-3402t)扩增反应曲线图；图12为本发明实验例1提供的混合型cyp2c19*17(c-3402t)扩增反应曲线图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的一种cyp2c19基因分型检测的核酸组合及检测试剂盒和应用进行具体说明。cyp2c19基因存在至少18种基因多态性，其中cyp2c19*2型(681g>a)和cyp2c19*3型(636g>a)引起cyp2c19基因编码的酶活性丧失,代谢底物的能力减弱,在接受推荐剂量波立维治疗时，心血管事件发生率较cyp2c19基因正常的患者上升。cyp2c19*17(-806c>t；-3402c>t)突变会导致cyp2c19酶的活性异常增强，使得服用氯吡格雷药物的患者增加服药后出血的风险。一种cyp2c19基因分型检测的核酸组合，核酸组合包括检测引物组合和检测探针组合；检测引物组合包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对；第一引物对的碱基序列分别如seqidno.1-2所示，第二引物对的碱基序列分别如seqidno.3-4所示，第三引物对的碱基序列分别如seqidno.5-6所示，第四引物对的碱基序列分别如seqidno.7-8所示；检测探针组合包括第一野生型检测探针、第一突变型检测探针、第二野生型检测探针、第二突变型检测探针、第三野生型检测探针、第三突变型检测探针、第四野生型检测探针和第四突变型检测探针；第一野生型检测探针的碱基序列如seqidno.9所示，第一突变型检测探针的碱基序列如seqidno.10所示；第二野生型检测探针的碱基序列如seqidno.11所示，第二突变型检测探针的碱基序列如seqidno.12所示；第三野生型检测探针的碱基序列如seqidno.13所示，第三突变型检测探针的碱基序列如seqidno.14所示；第四野生型检测探针的碱基序列如seqidno.15所示，第四突变型检测探针的碱基序列如seqidno.16所示；第一野生型检测探针、第二野生型检测探针、第三野生型检测探针和第一野生型检测探针的5’端标记有第一荧光基团，3’端标记有第二荧光剂基团；第一突变型检测探针、第二突变型检测探针、第三突变型检测探针和第四突变型检测探针的5’端标记有第三荧光基团，3’端标记有第二荧光剂基团。在进行反应的时候，第一野生型检测探针、第一突变型检测探针与第一引物对同时使用；第二野生型检测探针、第二突变型检测探针与第二引物对同时使用；第三野生型检测探针、第三突变型检测探针与第三引物对同时使用；第四野生型检测探针、第四突变型检测探针与第四引物对同时使用；四对不同的引物对，针对不同的位点，而不同的探针，则可以反应出不同的基因型；由于不同基因型的野生型检测探针与突变型检测探针标记的荧光基团不同，因此产生不同的荧光；通过不同荧光信号就可以判断出不同基因型，进行快速的基因分型。第一引物对对应cyp2c19*2基因；第二引物对对应cyp2c19*3基因；第三引物对和第四引物对均对应cyp2c19*17基因。进一步地，本发明的较佳实施例中，第一荧光基团为fam、mgb、vic、tet、joe、hex、cy3、cy5、rox、red610、texasred、red670和ned中的一种；第二荧光基团为fam、mgb、vic、tet、joe、hex、cy3、cy5、rox、red610、texasred、red670和ned中的一种；第三荧光基团为fam、mgb、vic、tet、joe、hex、cy3、cy5、rox、red610、texasred、red670和ned中的一种；第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团均不相同。第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团不同时选用一种荧光基团，方便进行荧光区分，更有利于检测的进行。上述的cyp2c19基因分型检测的核酸组合在cyp2c19基因分型检测中的应用。进一步地，本发明的较佳实施例中，进行pcr反应中，第一野生型检测探针和第一突变型检测探针的浓度之比为1-3:1；第二野生型检测探针和第二突变型检测探针的浓度之比为1:1-3；第三野生型检测探针和第三突变型检测探针的浓度之比为1-2:1；第四野生型检测探针和第四突变型检测探针的浓度之比为1:1-3。通过设置突变型探针与野生型探针的合理的浓度比值，能够提高检测的准确性。上述cyp2c19基因分型检测的核酸组合在制备cyp2c19基因分型检测的检测试剂盒中的应用。一种cyp2c19基因分型检测的检测试剂盒，cyp2c19基因分型检测试剂盒包括上述的cyp2c19基因分型检测的核酸组合。进一步地，本发明的较佳实施例中，还包括pcr反应缓冲液、taqdna聚合酶、dntps中的至少一种。试剂盒中，包括进行pcr的试剂，可以对样本进行；可以一次性的满足检测需要的一些试剂，节约实验流程，缩短实验周期，提高检测的效率。进一步地，本发明的较佳实施例中，pcr反应缓冲液主要由kcl、mgcl2、tris·hcl和水制得。进一步地，本发明的较佳实施例中，检测试剂盒还包括基因组提取试剂。在试剂盒中直接提供提取样本的基因组，将提取的基因组作为pcr反应的模板，进行反应；同样可以缩短检测周期，提高效率。上述的cyp2c19基因分型检测的检测试剂盒在cyp2c19基因分型检测中的应用。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供一种cyp2c19基因分型检测的核酸组合，核酸组合包括检测引物组合和检测探针组合。检测引物组合包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对；第一引物对的碱基序列分别如seqidno.1-2所示，第二引物对的碱基序列分别如seqidno.3-4所示，第三引物对的碱基序列分别如seqidno.5-6所示，第四引物对的碱基序列分别如seqidno.7-8所示。检测探针组合包括第一野生型检测探针、第一突变型检测探针、第二野生型检测探针、第二突变型检测探针、第三野生型检测探针、第三突变型检测探针、第四野生型检测探针和第四突变型检测探针；第一野生型检测探针的碱基序列如seqidno.9所示，第一突变型检测探针的碱基序列如seqidno.10所示；第二野生型检测探针的碱基序列如seqidno.11所示，第二突变型检测探针的碱基序列如seqidno.12所示；第三野生型检测探针的碱基序列如seqidno.13所示，第三突变型检测探针的碱基序列如seqidno.14所示；第四野生型检测探针的碱基序列如seqidno.15所示，第四突变型检测探针的碱基序列如seqidno.16所示。第一野生型检测探针、第二野生型检测探针、第三野生型检测探针和第四野生型检测探针的5’端标记有fam荧光基团，3’端标记有mgb荧光基团；第一突变型检测探针、第二突变型检测探针、第三突变型检测探针和第四突变型检测探针的5’端标记有vic荧光基团，3’端标记有mgb荧光基团。当然，在本发明的其他实施例中，第一野生型检测探针、第二野生型检测探针、第三野生型检测探针和第四野生型检测探针的5’端标记的荧光基团可作为第一荧光基团，还可以选择其他种类的荧光基团，比如mgb、vic、tet、joe、hex、cy3、cy5、rox、red610、texasred、red670和ned中的一种。第一野生型检测探针、第一突变型检测探针、第二野生型检测探针、第二突变型检测探针、第三野生型检测探针、第三突变型检测探针、第四野生型检测探针和第四突变型检测探针的3’端均标记了荧光基团mgb作为第二荧光基团，同理还可以选用其他种类的荧光基团进行标记，如fam、vic、tet、joe、hex、cy3、cy5、rox、red610、texasred、red670和ned中的一种。第一突变型检测探针、第二突变型检测探针、第三突变型检测探针和第四突变型检测探针的5’端标记有vic作为第三荧光基团，同理还可以选用其他种类的荧光基团进行标记，如fam、mgb、tet、joe、hex、cy3、cy5、rox、red610、texasred、red670和ned中的一种。在实验过程中，第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团不同时选用一种，且两两之间选用的荧光基团也不相同，保证检测的准确性，同时也能避免相互干扰，避免出现假阳性等现象。实施例2本实施例提供一种cyp2c19基因分型检测的检测试剂盒，试剂盒含有实施例1提供的核酸组合，该检测引物包括引物对，引物对的碱基序列分别如seqidno.1-2所示。cyp2c19基因分型检测的检测试剂盒还包括pcr反应缓冲液、taqdna聚合酶、dntps中的至少一种。pcr反应缓冲液为10×的反应缓冲液，由500mmkcl、25mmmgcl2、100mmtris以及双蒸去离子水按照1:1:1:2高压灭菌后配置而成。cyp2c19基因分型检测的检测试剂盒还包括基因组提取试剂。本实施例提供的cyp2c19基因分型检测的检测试剂盒的具体使用方法如下：样本基因组提取，具体步骤如下：样本制备：取待检者的血液样本，保藏备用。试剂准备工作，包括将edta溶液和sds溶液制成裂解细胞的缓冲液lb，异丙醇溶液制成结合液i，将te溶液制成结合液ii，将tris饱和酚制成漂洗液w1，氯仿异戊醇溶液制成漂洗液w2。1.1取待检样本离心，然后用pbs缓冲液溶解，成分振荡混匀，制成细胞悬液，避免出现组织团块；1.2吸取1.8ml的细胞悬液，加入到ep管中，12000rpm离心2min；1.3弃上清，收集细胞加入200μl的缓冲液lb，且加入2μl的蛋白酶k溶液，振荡混匀；1.4于70℃消化10min，简短离心，将纯化柱置于收集管中待用；1.5加入200μl的结合液i，再加入200μl的结合液ii，颠倒混匀，溶液转移至纯化柱内；1.6静置2min，12000rpm离心30s，弃收集管中的废液，并将纯化柱放回收集管；1.7向纯化柱中加入600μl的漂洗液w1，12000rpm离心30s，弃废液；1.8向纯化柱中加入600μl的漂洗液w2，12000rpm离心30s，弃废液；1.9向纯化柱中加入600μl的漂洗液w2，12000rpm离心2min，弃废液；1.10将纯化柱转移到另外的rnase-free的ep管中，室温放置3-5min；1.11向纯化柱中悬空加入50的洗脱液te，静置2min，12000rpm离心2min，收集离心得到的基因组dna溶液待用。取步骤1.11中提取的基因组dna作为模板，用第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对分别进行pcr反应。本实施例选用25μl的反应体系，其中基因组dna模板2μl，pcr反应缓冲液2.5μl，正向引物0.75μl，反向引物0.75μl，mgcl2溶液1.5μl，探针2μl，taqdna聚合酶0.5μl，然后加水补足至25μl。将第一野生型检测探针和第一突变型检测探针以2:1的浓度比加入到第一引物对的反应体系中；第二野生型检测探针和第二突变型检测探针以1:2的浓度比加入到第二引物对的反应体系中；第三野生型检测探针和第三突变型检测探针以1:1的浓度比加入到第三引物对的反应体系中；第四野生型检测探针和第四突变型检测探针以1:2的浓度比加入到第四引物对的反应体系中。pcr反应程序为95℃预变性4min，95℃变性15s，60℃反应35s，40个循环收集荧光信号，降温冷却。基因分型的评价方法见表1。表1检测结果分析实验例1本实验例提供对实施例2提供的试剂盒中的核酸组合的特异性进行检测。第一引物对对应cyp2c19*2基因，突变位点为g681a；第二引物对对应cyp2c19*3基因，突变位点g636a；第三引物对cyp2c19*3基因，突变位点c-806t和第四引物对均对应cyp2c19*17基因突变位点c-3402t。分别以4个位点的对应的野生型质粒、突变型质粒和混合质粒为模板，使用实施例2提供的检测试剂盒进行检测。pcr反应体系及反应程序参照实施例2。cyp2c19*2基因，突变位点为g681a的实验结果如图1到图3所示；图1为野生型质粒的实验结果，图2位突变型质粒的实验结果，图3为混合质粒的实验结果。cyp2c19*3基因，突变位点为g636a的实验结果如图4到图6所示；图4为野生型质粒的实验结果，图5为突变型质粒的实验结果，图6为混合质粒的实验结果。cyp2c19*17基因，突变位点为c-806t的实验结果如图7到图9所示；图7为野生型质粒的实验结果，图8为突变型质粒的实验结果，图9为混合质粒的实验结果。cyp2c19*17基因，突变位点为c-3402t的实验结果如图10到图12所示；图10为野生型质粒的实验结果，图11为突变型质粒的实验结果，图12为混合质粒的实验结果。从实验结果可以看出，使用本方法，都能较好的得到相应的扩增曲线，通过扩增曲线的ct值分析，得到相应的模板为野生型、突变型和杂合型，具有较好的区别度。实验例2本实验例提供对获得的待检样本进行检测，基因组dna的提取，pcr反应体系及反应程序参照实施例2。cyp2c19至少存在14种突变基因和18种等位基因突变。编码正常酶活性的基因是cyp2c19*1，cyp2c19等位基因主要是*1-*17；其中cyp2c19*2型(681g>a)和*3型(636g>a)引起cyp2c19基因编码的酶活性丧失,代谢底物的能力减弱,在接受推荐剂量波立维治疗时，心血管事件发生率较cyp2c19基因正常的患者上升。cyp2c19*17(-806c>t；-3402c>t)突变会导致cyp2c19酶的活性异常增强，使得服用氯吡格雷药物的患者增加服药后出血的风险。因此，检测cyp2c19的基因型信息可以判断患者对此类药物的代谢速率，指导氯吡格雷用药。具体基因型与代谢速度相关性见下表2：表2cyp2c19不同基因型与氯吡格雷代谢的相关性基因型别代谢速度cyp2c19*1/*1快cyp2c19*1/*17快cyp2c19*17/*17快cyp2c19*1/*2中等cyp2c19*1/*3中等cyp2c19*2/*2慢cyp2c19*3/*3慢通过反应pcr反应扩增曲线的ct值计算得到基因型；其余9个样本同样得到实验结果。结果如表3所示。表310份待检样本的分析结果从表2可以看出，样本1、2、3、5、7、9、10属于氯吡格雷中等代谢型，样本4、8属于氯吡格雷快代谢型，样本6属于氯吡格雷慢代谢型。综上所述，本发明实施例提供的cyp2c19基因分型检测的核酸组合具有较好的特异性和较高的灵敏度，使用该检测引物应用于检测，并应用于制备cyp2c19基因分型检测的核酸组合的检测试剂盒，都具有较好的特异性和较高的灵敏度；具有较高的实用性和较高的推广应用价值。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。sequencelisting<110>益善生物技术股份有限公司<120>一种cyp2c19基因分型检测的核酸组合及检测试剂盒和应用<160>16<170>patentinversion3.5<210>1<211>25<212>dna<213>人工序列<400>1cttagatatgcaataattttcccac25<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列<400>2cactttccataaaagcaaggttttt25<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3attgaatgaaaacatcaggattg23<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列<400>4caatatagaattttggatttcccag25<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<400>5gtttggaagttgttttgttttgc23<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列<400>6acacagctcatagctggcagaact24<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7caccttgattaaaaaaatgggc22<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<400>8tagcttgcagttccctaatgac22<210>9<211>17<212>dna<213>人工序列<400>9actatttcccgggaacc17<210>10<211>14<212>dna<213>人工序列<400>10tttcccgggaaccc14<210>11<211>14<212>dna<213>人工序列<400>11ctccccctggatcc14<210>12<211>14<212>dna<213>人工序列<400>12ccccctgaatccag14<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列<400>13catctgttctcaaagcatc19<210>14<211>18<212>dna<213>人工序列<400>14ttctgttctcaaagtatc18<210>15<211>15<212>dna<213>人工序列<400>15cagaacagacacctc15<210>16<211>17<212>dna<213>人工序列<400>16acagacatctcaccaag17当前第1页12