定量检测BCR‑ABL1P210型融合基因表达水平的RT‑PCR试剂盒的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种定量检测bcr-abl1p210融合基因表达水平的rt-pcr试剂盒。

背景技术：

慢性粒细胞白血病(cml)是起源于骨髓异常多能干细胞并始终伴有ph染色体和/或bcr-abl1融合基因的骨髓增殖性疾病(mpd)，占所有白血病的15％～20％，全世界发病率1～1.5/10万，各年龄组均可发病，男性稍多。cml最主要的细胞遗传学特征就是具有t(9；22)(q34；q11)易位形成的ph染色体。从细胞分子学层面来看，22号染色体上的bcr基因与9号染色体上的abl1基因发生融合形成了新的融合基因bcr-abl1。bcr基因的断裂点位置可影响疾病的表型。cml中bcr断裂位点95％以上的概率发生在主断裂点丛区(m-bcr，bcr基因12～16外显子，又称b1～b5)，形成的mrna编码210da分子量的融合蛋白p210(此时的融合基因bcr-abl1被称为bcr-abl1p210型融合基因)；小概率发生在次断裂点丛区(m-bcr，bcr基因1～2外显子)，产生较小的融合蛋白p190；极小概率发生在μ区(μ-bcr，bcr17～20外显子，又称c1～c4)编码较大的融合蛋白p230。bcr-abl1融合基因编码的蛋白均具有酪氨酸激酶活性，且酶活性不受机体调控，使造血细胞由生长因子依赖型转变为非依赖型，从而发生恶性转变。因此，检测bcr-abl1p210型融合基因对cml诊断治疗及微小残留病(mrd)的监测具有重要意义。

除cml外，急性淋巴细胞白血病(all)也是常见的具有ph染色体的白血病类型，25～30％的成人以及2～5％的儿童all患者均携带ph染色体，其中约35％的成人和20％的儿童融合基因为bcr-abl1p210型。因此cml的bcr-abl1p210型融合基因的检测同样适用于all。

实时荧光定量pcr(rt-pcr)是利用荧光信号的变化实时监测pcr扩增反应中每个循环扩增产物总量的变化，进而通过标准曲线对起始模板进行精确定量分析。与dna的rt-pcr相比，rna的rt-pcr在pcr扩增前增加了逆转录步骤，将细胞总rna逆转录成cdna。

荧光标记技术使用双标记taqman探针法。taqman探针是一种寡核苷酸，能与目标序列正向引物和反向引物之间的序列特异性配对。在taqman探针的5’末端连接有荧光基团，在3’末端连接有对应的猝灭基团。完整的taqman探针荧光基团和淬灭基团接近，使得5’端荧光基团发射的荧光被淬灭基团淬灭。但在pcr延伸反应进行时，具有5’外切酶活性的聚合酶将探针酶解，使得荧光基团与淬灭基团分离，检测到荧光信号。随着pcr反应的进行，释放出来的荧光基团不断积累，从而得到荧光信号随循环数变化的荧光曲线。根据此荧光曲线可以对扩增基因起始模板量进行计算。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种定量检测bcr-abl1p210融合基因表达水平的rt-pcr试剂盒。本试剂盒使用一步法rt-pcr技术，快速简便灵敏地检测bcr-abl1p210融合基因表达水平，能够更好地对具有bcr-abl1p210型融合基因的白血病患者的微小残留病进行监测。本试剂盒质控品为细胞裂解液，具有完整稳定长期保存rna的功能，并且可以消除质粒为质控品易污染的不利影响。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

定量检测bcr-abl1p210型融合基因表达水平的rt-pcr试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

阴性质控品，阳性质控品，

bcr-abl1p210型融合基因的正向引物、反向引物与标记探针，

所述阴性质控品为不表达bcr-abl1p210型融合基因、且表达内参基因的细胞裂解液，所述阳性质控品为表达bcr-abl1p210型融合基因、且表达内参基因的细胞裂解液。

(该细胞裂解液的细胞类型为人类细胞或动物细胞，与待测样品的细胞类型相同)

在上述试剂盒中，包括：内参基因abl1基因的正向引物、反向引物与标记探针。

在上述试剂盒中，所述abl1基因的正向引物序列为序列表的序列1；所述abl1基因的反向引物序列为序列表的序列2；所述abl1基因的标记探针序列为序列表的序列3。

在上述试剂盒中，所述bcr-abl1p210型融合基因的正向引物序列为序列表的序列4；所述bcr-abl1p210型融合基因的反向引物序列为序列表的序列5。

在上述试剂盒中，所述bcr-abl1p210型融合基因的标记探针序列为序列表的序列6。

在上述试剂盒中，所述阳性质控品为k562细胞裂解液；和/或，所述阴性质控品为hl60细胞裂解液。

在上述试剂盒中，还包括：线性标准品a和线性标准品b，

所述线性标准品a为将所述阴性质控品提取总rna后梯度稀释成所述内参基因拷贝数浓度不同的一系列溶液；

所述线性标准品b为将所述阳性质控品提取总rna后梯度稀释成bcr-abl1p210型融合基因拷贝数浓度不同的一系列溶液。

本发明还提供了一种定量检测细胞内目的基因表达水平的rt-pcr方法，该方法以不表达所述目的基因、且表达内参基因的细胞裂解液为阴性质控品，以表达所述目的基因、且表达所述内参基因的细胞裂解液为阳性质控品，与待测样品的细胞裂解液分别按照相同的方法提取总rna，然后对获得的三种总rna中的所述目的基因和内参基因分别进行rt-pcr检测，获得所述目的基因在待测样品中的表达水平。

在上述方法中，所述rt-pcr检测使用双标准曲线定量，制作所述双标准曲线使用的标准溶液分别为线性标准品a和线性标准品b，

所述线性标准品a为将所述阴性质控品按照与待测样品的细胞裂解液相同的方法提取总rna后，梯度稀释成所述内参基因靶标拷贝数浓度不同的一系列溶液；用于对所述内参基因的定量；

所述线性标准品b为将所述阳性质控品按照与待测样品的细胞裂解液相同的方法提取总rna后，梯度稀释成所述目的基因靶标拷贝数浓度不同的一系列溶液；用于对所述目的基因的定量。

在上述方法中，当所述目的基因为bcr-abl1p210型融合基因时：

所述rt-pcr检测所述目的基因使用的正向引物、反向引物和标记探针的序列分别为序列表的序列4至序列6；

和/或，所述内参基因为abl1基因；检测该基因的正向引物、反向引物和标记探针的序列分别为序列表的序列1至序列3；

和/或，所述阳性质控品为k562细胞裂解液；

和/或，所述阴性质控品为hl60细胞裂解液。

在上述试剂盒和方法中，所述线性标准品a中内参基因(abl1基因)靶标浓度依次为10⁶、10⁵、10⁴、10³拷贝/5μl；

所述线性标准品b中目的基因(bcr-abl1p210型融合基因)靶标浓度依次为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/5μl。

阳性质控品中目的基因(bcr-abl1p210型融合基因)靶标浓度为10⁶拷贝/5μl。

阴性质控品中内参基因(abl1基因)靶标浓度为10⁶拷贝/5μl。

上述标记探针均为taqman探针。

本发明与其它检测白血病融合基因的方法相比，具有如下特点：

(1)采用细胞裂解液作为标准品和质控品，具有完整稳定长期保存rna的功能，并且可以消除质粒为质控品易污染的不利影响；还可以与检测样本(如外周血)一样参与总rna提取，能够更好地反映提取过程对细胞总rna的影响，可以消除不同实验室因提取条件不同造成的融合基因表达水平的变化。

(2)全封闭式的反应，加入待检测rna后无需开盖进行中间操作，反转录与qpcr可以在一个体系先后进行，不仅具有防污染效果，而且省时省力。

(3)双标准曲线定量，bcr-abl1p210型融合基因与abl1基因在细胞内的表达水平是有差异的，采用双标准曲线定量，能够更准确地测定两个基因的表达水平。

(4)高灵敏度与特异性，本发明的检测体系可以达到分子学反应mr4.5，即可以检出并准确定量bcr-abl1p210/abl1等于1/32000体系中的bcr-abl1p210；本发明体系所使用的引物是来自欧洲白血病权威指南文献，其特异性经过国际认可。

附图说明

本发明有如下附图：

图1为bcr-abl1p210型融合基因线性标准品的rt-pcr扩增曲线。

图2为bcr-abl1p210型融合基因的标准曲线。

图3为abl1基因线性标准品的rt-pcr扩增曲线。

图4为abl1基因的标准曲线。

图5为阳性质控品、阴性质控品的rt-pcr扩增曲线。

图6为bcr-abl1p210型融合基因的灵敏度实验结果。

图7为bcr-abl1p210型融合基因的特异性实验结果。

图8为五份白血病患者样品检测结果展示。

图9为分子学反应mr4.5的样本检测报告。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明所涉及的试剂盒包括：一步法rt-pcr反应体系、abl1基因的引物探针预混液、bcr-abl1p210型融合基因的引物探针预混液、abl1基因的线性标准品、bcr-abl1p210型融合基因的线性标准品、阳性质控品、阴性质控品。

abl1基因的引物探针预混液和bcr-abl1p210型融合基因的引物探针预混液均包括正向引物、taqman探针、反向引物。

一步法rt-pcr反应体系为购自abi公司的试剂。

abl1基因正、反向引物与探针的序列及其反应开始时终浓度分别为：

5’-tggagataacactctaagcataactaaaggt-3’(序列表序列1)，终浓度为0.2μm；

5’-gatgtagttgcttgggaccca-3’(序列表序列2)，终浓度为0.2μm；

5’fam-ccatttttggtttgggcttcacaccatt-bhq1-3’(序列表序列3)，终浓度为0.1μm；

bcr-abl1p210型融合基因正、反向引物与探针的序列及其反应开始时终浓度分别为：

5’-tccgctgaccatcaayaagga-3’(序列表序列4)，终浓度为0.2μm；(“y”为简并碱基，代表c或t)

5’-cactcagaccctgaggctcaa-3’(序列表序列5)，终浓度为0.2μm；

5’fam-cccttcagcggccagtagcatctga-bhq13’(序列表序列6)，终浓度为0.1μm；

其中，fam为荧光报告基团，bhq1为荧光猝灭基团。

abl1基因的线性标准品为hl60细胞裂解液；(bcr-abl1p210阴性细胞名称为hl60细胞；购买自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心；该细胞为不表达bcr-abl1p210融合基因的细胞，因此作为阴性质控；可用其它不表达bcr-abl1p210融合基因的细胞进行替换。)

bcr-abl1p210型融合基因的线性标准品为k562细胞裂解液；(bcr-abl1p210阳性细胞名称为k562细胞；购买自中国食品药品检定研究院细胞资源保藏研究中心；该细胞为表达bcr-abl1p210融合基因的细胞，因此作为阳性质控；目前无可替换细胞。)

上述标准品中细胞浓度均为5×10⁶个/管，该标准品在使用实验室进行提取总rna后，abl1基因浓度为10⁷拷贝/5μl，梯度稀释成10⁶、10⁵、10⁴、10³拷贝/5μl待用。bcr-abl1p210型融合基因靶标浓度为10⁷拷贝/5μl，梯度稀释成10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/5μl待用。

阳性质控品为k562细胞裂解液，细胞浓度为1.6×10⁶个/管。该质控品在使用实验室进行提取总rna后，bcr-abl1p210型融合基因靶标浓度为10⁶拷贝/5μl。

阴性质控品为hl60细胞裂解液，细胞浓度为1.6×10⁶个/管。该质控品在使用实验室进行提取总rna后，abl1基因靶标浓度为10⁶拷贝/5μl。

一、试剂盒保存

本发明的试剂盒储存条件为：4℃避光储存至少2个月，-20℃避光储存1年。其中的线性标准品及阴性质控品、阳性质控品需-20℃储存。

二、样品要求

优先推荐使用新鲜采集的血液作为样品，使用红细胞裂解液处理全血，获得有核细胞沉淀，收集有核细胞沉淀，加入trizol试剂后混匀，获得trizol裂解液，备用。trizol裂解液保存样品的保存时间为：4℃不超过24h，-20℃不超过5年，且反复冻融次数不超过10次。

三、样品处理

1、相分离：

取样品的trizol裂解液1ml，加入200μl的三氯甲烷。小心盖好样品管。用手大力摇管15秒，15-30℃孵育2-3分钟。2-8℃不超过12000g离心15分钟。离心后混合物分离为红色下层(酚-氯仿相)、中间相以及上层的无色水相。rna存在于水相。

2、rna转移：

将水相转移到一个新管，加入0.5ml异丙醇，15-30℃孵育10分钟，2-8℃不超过12000g离心10分钟，以从水相中沉淀rna，离心后在管侧面和底部可见凝胶样沉淀。

3、rna洗涤：

弃上清，用1ml75％的乙醇洗涤rna沉淀，涡旋混合。2-8℃，不超过7500g离心5分钟。弃上清，室温10min使乙醇挥发。

4、rna溶解：

加入100μldepc-ddh2o将rna溶解，作为后续rt-pcr反应的模板。

四、线性标准品及阴性质控品、阳性质控品的制备

线性标准品及阴性质控品、阳性质控品均为细胞系裂解液(通过在一定量培养的细胞中加入trizol试剂制成，与步骤二差别在于不需要对红细胞进行处理，培养的细胞均为有核细胞)，参与实验室提取。按照步骤三中样品处理的方式对线性标准品及阴性质控品、阳性质控品进行rna提取。阴性质控品、阳性质控品提取出rna后即可作为最终质控品使用，而线性标准品则需要进行梯度稀释。首次提出的线性标准品靶标浓度为10⁷拷贝/5μl，取1μl加9μldepc-ddh2o进行稀释，短暂涡旋混匀得10⁶拷贝/5μl的标准品，继续按此方式混合出10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/5μl的标准品待用。

五、rt-pcr扩增反应条件

扩增仪器为bioradcfx96荧光定量pcr仪。

扩增体系为25μl，其中mastermix(含逆转录酶、udg酶、dna聚合酶、dntp)18μl，bcr-abl1p210型融合基因或abl1基因的引物探针混合液2μl，样品或质控品5μl。

扩增内容包括：abl1基因线性标准品10³～10⁷拷贝/5μl，每个浓度进行1个反应；bcr-abl1p210型融合基因线性标准品10¹～10⁶拷贝/5μl，每个浓度进行1个反应；阳性、阴性质控品各进行1个反应。样本abl1基因检测进行1个反应，bcr-abl1p210型融合基因检测进行2个反应。

扩增条件按表1设置：

表1

六、标准曲线的制备

以abl1基因标准曲线制备为例进行说明。10³～10⁷拷贝/5μl的5个线性标准品经qpcr扩增得到ct值，对ct值与拷贝数的lg值作图，拟合得到lg[copies]-ct的线性标准曲线与线性方程。利用该标准曲线即可对未知样本进行初始拷贝数计算。只要在实验条件下扩增未知样本，得到ct之后即可根据lg[copies]-ct的线性标准曲线与线性方程得到初始拷贝数。

bcr-abl1p210型融合基因标准曲线制备方法与abl1基因相同。

七、结果判读

基线和阈值的设定：基线一般设定为3～15；阈值移动至扩增图斜率的1/2位置，当然还可根据实际情况酌情调整。

检测应符合以下要求，否则本次检测无效：

1)阴性质控品应无任何扩增，阳性质控品应出现s型扩增曲线，且ct值应≤30.0。

2)标准曲线的相关系数应介于0.99～1.0之间，斜率介于-3.0～-4.0之间。

3)若样品的abl1内参基因的拷贝数≥10⁴，则认为结果可靠。若样品的abl1内参基因的拷贝数<10⁴，不仅敏感度不够，而且有可能影响最终定量结果的准确度，建议逆转录时增加模板rna的量或重抽提标本。

4)bcr-abl1p210型融合基因及abl1内参基因扩增建议均做平行管扩增，取两次结果的平均值，以保证结果可靠。

读取每份标本bcr-abl1p210型融合基因和abl1内参基因的ct值，通过标准曲线确定基因的拷贝数，根据下列公式计算结果：

定量检测结果(％)＝bcr-abl1p210型融合基因拷贝数/abl1内参基因拷贝数×100％

阳性结果：有s型扩增曲线，并且bcr-abl1p210型融合基因大于等于10拷贝，同时阴性质控品应无任何扩增。

阴性结果：无s型扩增曲线，或有s型扩增曲线，bcr-abl1p210型融合基因小于10拷贝，且阳性质控品出现s型扩增曲线。

八、试剂盒的检测结果如下：

图1为bcr-abl1p210型融合基因线性标准品浓度分别为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/test(从右至左)rt-pcr扩增反应的扩增曲线。其标准曲线如图2所示。

图3为abl1基因线性标准品浓度分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³拷贝/test(从右至左)rt-pcr扩增反应的扩增曲线。其标准曲线如图4所示。

图5为阳性质控品、阴性质控品的rt-pcr扩增曲线。结果表明，阳性质控品的三个重复实验组均有扩增，而阴性质控品的三个重复均无扩增。

九、试剂盒的灵敏度及特异性

1)用质粒进行灵敏度实验

将含有bcr-abl1p210型融合基因的质粒稀释成10拷贝/5μl浓度，使用步骤五的扩增方法进行扩增，重复4次查看是否具有扩增曲线，以及用标准曲线进行初始拷贝数定量计算，对比稀释结果。

结果如图6所示，四条扩增曲线均为10拷贝含bcr-abl1p210性融合基因的质粒dna的扩增结果，实测ct值分别为36.15、36.38、36.68、37.13，均值为36.6。10拷贝通过bcr-abl1p210型融合基因的标准曲线理论计算得到ct值为35.1，偏差百分比4.3％。

2)使用ebv转化的b淋巴细胞进行特异性实验

因为正常人的淋巴细胞表达abl1基因而不表达bcr-abl1p210型融合基因，利用ebv转化的b淋巴细胞(非bcr-abl1p210型融合基因)检测步骤五中bcr-abl1p210型融合基因的扩增体系是否出现假阳性可以判断本发明试剂盒的特异性。

结果如图7所示，使用bcr-abl1引物检测ebv转化的b淋巴细胞(非bcr-abl1p210融合基因型)，结果均为无特异性扩增曲线，证明本发明的试剂盒特异性良好。

十、试剂盒检测白血病患者样品

利用本发明试剂盒按照前述方法检测五份白血病患者样品的bcr-abl1p210型融合基因，检测结果如图8所示。

利用本试剂盒检测bcr-abl1p210低拷贝样本，结果如图9所示。左侧两条曲线为样本abl1基因扩增曲线，右侧两条曲线为bcr-abl1p210基因扩增曲线，利用图2与图4得出的标准曲线计算abl1与bcr-abl1p210扩增拷贝数分别为730017拷贝和10拷贝，因此bcr-abl1/abl1＝1.4×10^-5，达到了分子学反应mr4.5的标准。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

序列表

<110>北京旌准医疗科技有限公司

<120>定量检测bcr-abl1p210型融合基因表达水平的rt-pcr试剂盒

<141>2017-09-18

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