一种控制水稻叶片衰老的基因及其编码的蛋白质的制作方法

本发明属于水稻基因工程领域，具体涉及一种控制水稻叶片衰老的基因，还涉及该基因编码的蛋白质。
背景技术：
：叶片作为光合作用的主要场所，而衰老是叶片发育的最后阶段。在水稻、小麦等许多作物上普遍存在的叶片早衰，既阻碍了产量潜力的发挥，又导致品质的下降。对已克隆的43个与衰老相关基因的研究表明，水稻衰老是一个质量性状且大多受核单基因控制，其中与衰老正相关的基因有21个，以衰老过程中的代谢和加工过程基因为主，如编码叶绿体蛋白的基因SGR和SGRL、编码脱氢还原酶的NOL等；与衰老负相关的基因22个，主要参与转录因子调控和生物合成以及信号途径，如编码ERF域的转录因子的基因SUB1A、编码F-box和LRR域的蛋白的基因D3等(翟荣荣等.中国稻米.2011年第1期)。经检索，没有发现能同时调控水稻叶片衰老和株型的基因的报道。技术实现要素：本发明人在蜀恢527所构建EMS(甲基磺酸乙酯)诱变库中意外发现一个叶片早衰突变体材料yld1，进一步的研究发现控制该水稻叶片衰老的基因能同时调控水稻叶片衰老和水稻株高。本发明是在上述意外发现的基础上形成的。本发明的目的在于提供一种控制水稻叶片衰老的蛋白质。本发明另一目的在于提供编码上述蛋白质的基因，该基因不仅具有控制水稻叶片衰老的功能，还可以调控水稻株型，以此为基础可用来培育水稻新株型和进行水稻品种改良。本发明第三目的在于提供含有干涉上述基因的表达载体。本发明第四目的在于提供上述基因在控制水稻叶片衰老上的用途。实现本发明的技术方案如下：本发明提供一种控制水稻叶片衰老的蛋白质，命名为YLD1，是如下(1)或(2)：(1)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成。(2)对序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经由一个或几个氨基酸的添加、取代或缺失而产生的，并且具有控制水稻叶片衰老功能的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还提供一种编码上述蛋白质的基因，命名为YLD1，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列组成。(b)对序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经由一个或几个核苷酸的添加、取代或缺失而产生的、且编码与(1)相同的控制水稻叶片衰老功能蛋白质的核苷酸序列组成。本发明还提供了含有上述基因的表达载体。所述的表达载体是指质粒或植物表达载体或宿主细胞。所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。本发明还提供了上述基因在控制水稻叶片衰老上的应用。本发明还提供利用上述基因调控水稻叶片衰老和株型的方法，包括将上述基因转化到水稻品种中。本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明基因为同时控制水稻叶片早衰和株型的新基因，为水稻叶片早衰和水稻株型的改良提供了一个新途径。(2)本发明基因可用于水稻育种中对水稻叶片早衰材料筛选，以及用于杂交育种后代材料叶片早衰材料的早期鉴定和筛选。(3)为水稻叶片早衰的机理研究提供了一个很好地基础，并可用于改良水稻叶片早衰育种材料的创制中。附图说明图1、分蘖初期蜀恢527和突变体yld1表型对比照片；其中1为蜀恢527；2为突变体yld1。图2、抽穗期蜀恢527和突变体yld1表型对比照片；其中1为蜀恢527；2为突变体yld1。图3、分子标记RM527的电泳条带示意图；其中1为扬稻6号；2为突变体yld1；3为交换单株。图4、分子标记X32的电泳条带示意图；其中1为扬稻6号；2为突变体yld1，3为交换单株。图5、早衰候选基因的初定位示意图。图6、共分离检测引物X301的电泳图谱；其中1为DNAMarker；2为突变体yld1。图7、引物P980扩增的电泳图谱；其中1为DNAMarker；2为蜀恢527，3为突变体yld1。图8、引物P846扩增的电泳图谱；其中1为DNAMarker；2为阳性大肠杆菌转化子。图9、引物P852扩增的电泳图谱；其中1为DNAMarker；2为水稻Kasalath品种。图10、YLD1-RNAi载体示意图。图11、引物P1028扩增条带的电泳图谱；其中1为DNAMarker，2为阳性农杆菌转化子。图12、转YLD1-RNAi阳性植株的照片；其中1为阴性对照；2为转空载对照；3到8为转基因阳性植株。图13、转YLD1-RNAi阳性植株的叶片中YLD1基因的相对表达量检测柱形图；其中1为阴性对照的叶片；2为转空载对照的叶片；3到8为转基因阳性植株叶片。具体实施方式实施例1:突变体分离与遗传分析试验(一)试验材料早衰突变体yld1，扬稻6号和蜀恢527均来源于四川农业大学水稻研究所杂种优势利用实验室。(二)试验方法突变体yld1，扬稻6号和蜀恢527等所有试验材料均种在四川农业大学水稻研究所温江试验场，利用突变体yld1与扬稻6号或蜀恢527分别构建F2群体，统计F1和F2群体的分离比。表型观测结果：与野生型相比，突变体yld1在分蘖期开始部分叶片出现叶尖黄化表型(见图1),到抽穗期所有叶片叶尖均较野生型蜀恢527提前变黄(见图2)。分离试验结果：利用突变体yld1与扬稻6号或蜀恢527分别杂交获得F1，F1代植株均具有正常的叶片表型和生育期，F2代中的野生型和突变体早衰表型的分离比，经卡方检验，符合孟德尔单基因隐性突变的分离比3:1(见表1)，说明突变体yld1的早衰表型是受单隐性核基因控制。表1突变体yld1的分离试验结果注：χ20.05,1＝3.84实施例2:突变体yld1候选基因的定位分析试验(一)试验材料和方法1.近等基因池的构建从突变体yld1与扬稻6号杂交而得到F2群体中，随机选取30份有早衰表型的单株叶片和10份正常单株叶片，每10株的叶片等量混合提取DNA建池，包括3个隐性池和1个显性池在内的共计4个近等基因池用于基因初定位。叶片DNA的提取采用改进CTAB法。2.引物的合成和基因定位先利用平均分布于水稻12条染色体上的近300对SSR引物(具体序列详见水稻基因组网站http://www.gramene.org/bd/markers)，通过PCR扩增，筛选出突变体yld1和扬稻6号基因组之间的144条多态性引物；随后用筛选出的多态性引物检测4个近等基因池，以及突变体yld1与扬稻6号构建的F2群体中隐性单株，进行基因初步定位；在已初定位的区间内，依据http://www.gramene.org网站公布的扬稻6号和日本晴DNA序列之间的差异序列，设计Indel引物RM527和X32(见表2)，其相应的PCR扩增产物(见图3和图4)，继续检测4个近等基因池和突变体yld1与扬稻6号构建的F2群体中的隐性单株，进行精细定位。表2本实施例中所用的定位引物名称前引物(5'-3')后引物(5'-3')片段长度(bp)RM527CGGTTTGTACGTAAGTAGCATCAGGTCCAATGCCAACAGCTATACTCG106X32CACAAGCCGTAGCAGAGCTAAAGACACCGCCATTCC130其中PCR反应体系为(20μl)：Tap酶(5U/μL)0.2uL，Primer(10mmol/L)2uL，dNTP(2.5mmol/L)2uL，DNA(20-100ng/μL)2uL，10×Buffer(25mM)2uL，ddH2O11.8uL。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环；72℃8min；20℃2min。电泳检测：在3.0％的琼脂糖凝胶、恒压120-150V电泳2-3h左右，用凝胶成像系统成像并保存记录。3.连锁图谱的构建将带型为突变体yld1的单株标记为0，带型为杂合的单株记为1，带型为亲本的单株记为2，未出带的单株记为3，通过用MAPMARKER3.0软件对F2分离群体中分子标记和突变性状的分离数据进行连锁分析，再将重组值转化为遗传图距(centMorgan,cM)。4.候选基因初定位结果首先利用比较均匀分布在水稻12条染色体上的300对SSR引物，分析突变体yld1和扬稻6号之间多态性，从中筛选出了144对平均分布水稻12条染色体上的多态性引物。然后利用该144对多态性引物在近等基因池和F2群体中隐性单株进行筛选，结果(见图5)表明第6号染色体上的着丝粒附近RM162，RM345和RM527均与候选基因有一定的连锁关系。通过在该区段内继续开发Indel标记，最终将突变基因(见图5)初步定位在第6号染色体上包含着丝粒在内的X32与RM527区段，其间物理距离为7.3Mb区间内。5.MutMap的回交群体构建和测序分析以突变体yld1为母本，经蜀恢527为父本连续回交2代，再自交一代构成BC1F2回交群体。从该回交群体中取30个有早衰表型植株的叶片，每10株叶片等量混合提取DNA，共计3个池，连同蜀恢527植株的DNA送公司重测序，利用生物信息学分析和比较突变体和野生型之间可能存在的SNP差异，进一步确定候选基因。利用X301引物对蜀恢527、突变体yld1、突变体yld1与蜀恢527构建的BC1F2回交群体中的3个隐性池以及突变体yld1与扬稻6号构建的F2代中的3个隐性池进行共分离测序分析，X301的引物序列如下：X301-F：5'-CAATAATCGGACAGTAAAG-3'(SEQIDNo:3)X301-R：5'-AAGATCACAGCACCATAT-3'(SEQIDNo:4)PCR产物长度为407bp(见图6)。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环；72℃8min；20℃2min。6.MutMap重测序结果因在重组频率很低的着丝粒附近，难以找到有效的与突变基因连锁的分子标记，结合MutMap重测序技术分析结果，得到均位于第6号染色体上的3个候选基因(见表3)，其中LOC_Os06g35160不在初定位区段内。共分离测序分析结果与MutMap重测序分析结果相吻合：6个隐性池的点突变位点与突变体一致，即该基因发生单碱基替换(由G变为A)，且峰值都表现为单峰，表明该突变位点与早衰性状完全连锁。结合初定位和MutMap重测序以及共分离测序验证的结果，LOC_Os06g29380基因很可能是候选目的基因。表3MutMap重测序预测的候选基因染色体位置点突变SNP值基因登录号预测的功能Chr6:15,886,23A->G1.00LOC_Os06g27990逆转座子Chr616,798,46G->A0.9583LOC_Os06g29380磷脂转运P4ATPase酶Chr620,490,70C->T1.00LOC_Os06g35160钙调蛋白激酶实施例3:候选基因的克隆与测序验证(一)实验材料与方法1.RNA的提取RNA提取步骤操作是按Trizol试剂说明书进行。2.cDNA第一条链的合成：按照TOYOBOReverTraAce-aTM说明进行：3.基因片段扩增使用Primer5.0软件，对由MutMap方法预测的候选基因LOC_Os06g29380，根据RiceGenomeAnnotationProject(http://rice.plantbiology.msu.edu/)网站上的参考cDNA序列，分别设计引物(见表4)，以第二步分别反转录得到的蜀恢527和突变体yld1的cDNA为模板，用P980引物进行PCR反应，得PCR扩增产物(见图7)，其中反应条件如下:基因扩增的PCR反应体系(50μL)：cDNA模板1μL，dNTPMixture(2.0mM)5μL，10×PCRbuffer5μL，MgSO4(25Mm)2μL，Primers15pmoleseach，KOD-Plus(1U/μl)1μL，ddH2Oto50μL。PCR反应程序：94℃5min；94℃15s，68℃1min，30个循环；72℃5min。表4本实施例中所用的引物名称前引物(5'-3')后引物(5'-3')片段长度(bp)P980ATGGCCGGGGGGAGGAGGAGCAGTCCCTGAACTTGTAATTCGGTTTCCTTC3600P846CCTCCTCCAATCCTCAATGCCTTCATTTTGCTGCCGGTCA5004.纯化和回收PCR产物目的DNA片断胶回收操作步骤参照OmegaGelExtractionKit产品说明书进行：取2μL胶回收产物置于1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，检测后放入-20℃保存。5.基因目的片段与克隆载体的连接连接体系如下(5μL)：目的片段2-4.5μL，pEASY-Blunt载体0.5μL。将经胶回收而来的蜀恢527和突变体yld1的cDNA片段，按上述体系连接到克隆载体。一般情况下，目的片段溶液：载体溶液(V/V)＝3：1－10：1，连接体系25℃条件下反应30分钟，得连接产物。6.大肠杆菌转化(1)从-80℃冰箱中取出一管制备好的大肠杆菌感受态细胞，置于冰上融化；(2)每100ng连接产物加入100μL感受态细胞悬浮液，混匀后在冰上放置30min；(3)42℃热激30s，迅速取出立即置于冰上2min；(4)加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃、200r/min培养1小时左右活化菌液；(5)将活化的菌液以5000r/min离心1min，在无菌条件下倒掉大部分上清夜，用移液枪轻轻的重悬沉淀的菌，使其悬浮在100μL左右的LB液体培养基中，在超净台上把菌液转移并涂到含有抗生素的LB筛选平板上；(6)将涂有菌液的LB平板培养基正面向上放置十分钟左右，待菌液完全被LB固体培养基吸收后将涂板的培养基倒置，37℃的恒温箱中过夜培养；(7)挑取单菌落，利用P846引物进行菌液PCR检测,得PCR扩增产物(见图8)；其中P846引物的PCR反应体系(20uL)：Tap酶(5U/μL)0.2uL，Primer(10mmol/L)2uL，dNTP(2.5mmol/L)2uL，DNA模板(20-100ng/μL)2uL，10×Buffer(25mM)2uL，ddH2O11.8uL。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环；72℃8min，20℃2min。(8)将阳性克隆加入3ml含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养液中，置于37℃摇床上，200r/min培养约10h，保存菌液并提取质粒。7.大肠杆菌质粒的提取按照OMEGAPlasmidExtractionKit产品说明书的方法提取大肠杆菌质粒，质粒DNA收集到干净的离心管中，-20℃保存。8.DNA序列的测定和序列分析将阳性克隆质粒送到成都擎科科技股份有限公司进行测序。用DNAMAN软件对测序结果进行序列比对，并分析扩增目的片段在蜀恢527和yld1之间的差异。对该基因的全长编码区在蜀恢527和突变体yld1(SEQIDNO.1)中进行测序比较，发现在第10外显子上发生单碱基替换(由G变为A)，导致由中性的甘氨酸(G)变为酸性的天冬氨酸(D)。与蜀恢527中该基因翻译的蛋白质序列相比，突变体yld1中LOC_Os06g29380基因上的单碱基替换(由G变为A)，造成氨基酸改变(SEQIDNO.2)，从而影响该基因编码蛋白的生物学功能，导致早衰表型的产生。实施例4：候选基因的功能验证(一)实验材料与方法1、试验材料本试验所用大肠杆菌菌株DH5α和农杆菌菌株EH105以及水稻Kasalath品种均来自于四川农业大学水稻研究所杂种优势利用实验室。2.YLD1-RNAi载体构建利用YLD1在水稻中同源序列最少的、且是该蛋白比较保守的区域设计PCR扩增引物P852，片段长度约为439bp(见图9)，胶回收后参照GATEWAYLRClonaseIIenzymemix使用手册进行重组反应。最终构成能降低YLD1基因正常表达的干涉载体YLD1-RNAi(见图10)。按照上述方法，转化大肠杆菌，用P1028引物进行菌液PCR检测阳性单菌落克隆后(见图11)，送公司测序验证后备用。3.农杆菌化学转化法1)按照一个质粒：50ul感受态细胞从-80拿出来时快速放手心化冻。2)加0.4-1ug构建好的YLD1-RNAi质粒于50ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。3)液氮中冷冻2分钟。4)37℃水浴2min,溶化细胞。5)立即加入5倍体积的无抗LB培养基，28℃摇床培养2-3hr(170rpm)。6)7000rpm离心2分钟，悬浮细胞在100ulLB培养基中。7)涂在利福平加卡那抗性板，吹干，28℃培养2-3天。8)用潮霉素分子标记P1028引物进行菌液PCR检测，将阳性农杆菌单克隆(图11)，加入甘油作为保护剂后置于-80C保存备用。4.农杆菌浸染法转化水稻(1)愈伤组织的诱导：籼稻Kasalath种子先用75％酒精消毒1分钟，用无菌水漂洗3次，再用40％的次氯酸钠漂洗30分钟，再用无菌水冲洗5次，放置于带滤纸的培养皿中滤干，用镊子接种于NMB培养基上，于28℃光培养7天。每7天继代一次。继代2～3次后，挑取从种子上生长出的良好愈伤组织，把它们继代于预培养基上，28℃暗培养4天。(2)农杆菌菌株的活化：将-80C保存的30ul农杆菌加入3mL含有利福平和卡那霉素的YEP液体培养基中，于28℃下振荡培养14h；再取其中1mL于含有利福平和卡那霉素的50mL的YEP液体培养基中28℃再振荡培养4h。(3)共培养转化：将活化好的菌液在5000rpm下离心收集菌体，用含有100μM/L乙酰丁香酮的AAM液体培养基30mL重悬菌体，将预先挑好的愈伤组织浸于菌液中20min，吸去多余的菌液，平铺于共培养固体培养基上，28℃暗培养2d。(4)愈伤脱菌培养与愈伤抗性筛选：将共培养2d后的愈伤组织用无菌水冲洗至水澄清，然后用含头孢霉素(500mg/L)的无菌水振荡30min杀菌，将愈伤组织用无菌滤纸或吸水纸彻底吸干，然后接种于选择培养基上培养3周左右。(5)转基因植株的分化与生根：将上述新长出的抗性愈伤组织接种到分化培养基上，光照培养1-2个月，然后将长出的3cm左右高的幼苗转到生根培养基上进行生根培养，当苗长至约10cm时，取叶片提DNA利用潮霉素引物鉴定阳性植株苗，最终获得70株转基因阳性植株。(6)将阳性转基因植株室内炼苗后，再移栽于大田。5.RT-qPCR鉴定阳性转基因植株中YLD1基因的表达情况(1)RNA提取取分蘖盛期的转基因植株叶片提取RNA，具体方法详见实施例3。(2)cDNA第一链合成按照TaKaRa说明书进行：(3)qPCR检测转基因植株中YLD1基因的表达量YLD1基因的定量引物为P814,内参基因引物为UBQ(引物序列见表5)。采用三次技术重复和三次生物学重复进行qPCR实验.将上述cDNA稀释20倍后，取其中1μL作为PCR模板，用SsoFastEvaGreenSupermix(Bio-Rad)试剂在Bio-RadCFX96real-timesystem上检测基因表达。具体qPCR反应条件如下：基因扩增的PCR反应体系(10μL)：cDNA模板：1μL，ddH2O：3μL，Primers：1μL，Supermix：5μL。PCR反应程序：95℃1min；95℃15s，58℃30s，40个循环；60℃-98℃0.5℃/s。表5本实施例中所用的引物名称前引物(5'-3')后引物(5'-3')片段长度(bp)P852CTCAGCGCATTGTACACCTTCCAACTTTGATATCCTTCCATTTT451P1028TACACAGGCCATCGGTCCAGATAGGAGGGCGTGGATATGTC900P814GATTGGAGGAGGAAACATCAGGACAGAACCAAATCTGCAGGAAAGA160UBQGGAAGTAAGGAAGGAGGAGCAGAGGTGATGCTAAGGT150结果最终获得的70株转基因阳性植株不仅均表现为不同程度的叶片早衰和株型矮化(见图12)，阳性转基因植株中的YLD1基因的表达量均显著下调(图13)表明叶片早衰表型与RNAi干涉效果成正相关。上述结果说明YLD1是调控水稻衰老和株高的基因。当前第1页1 2 3