本发明涉及了一种菌培养方法及其应用，尤其是涉及了一种益生菌的高密度培养方法及其应用。
背景技术：
益生菌，英文probiotics一词由希腊语“for live”派生而来，译为“为了生命”，是含有生理活性的活菌，当被机体经过口服或其他给药方式摄入适当的数量后，能够定植于宿主并改善宿主微生态平衡，从而发挥有益作用。近年来的研究表明，人体内的细菌多达1000多种，特别是胃肠道内的细菌最为丰富，占全身微生态菌总数80％左右，是人体细胞的10倍，被誉为人类的“第二基因组”。这些细菌有助于人体消化食物，产生维生素以预防食物中细菌所诱发的疾病，同时刺激免疫系统。随着研究的深入，发现肠道微生物在许多慢性疾病和症状中，如炎症、肥胖、糖尿病、还有癌症等也起了关键作用。微生物的数量和基因数量惊人，强烈影响人类的健康。这些发现为益生菌产品在食品、保健品、医药、养殖、环境、卫生用品等领域的应用带来了巨大的推动力。目前，益生菌被广泛用于酸奶、乳酸菌饮料、益生菌粉剂、动物饲料、环境治理等产品中，形成了相对完整和成熟的益生菌行业。
值得注意的是，益生菌只有达到一定的数量水平时，益生菌才能在宿主体内产生相应的效果。所以，以益生菌为功能成分的食品、保健品或药品需要保证所含活的益生菌数量保持在一定的水平。这一需求对益生菌的生产和制备提出了相应的要求。在益生菌的培养过程中，实现高密度培养，不但可以满足后续益生菌产品的功能需求，还可以提高益生菌生产环节中的生产效率，减少培养体积，缩短生产周期，降低生产成本。因此，益生菌的高密度培养是当前益生菌开发和生产中的关键技术问题。
液体发酵体系中，中国发明专利(公开号：CN 101230323A)在培养过程中添加碱性盐和脱氧剂以消除嗜酸乳杆菌或两歧双歧杆菌发酵时所受到的胁迫物质酸或氧，使最终产品中活菌数量提高2-4倍。中国发明专利(公开号：CN 101418270A)在干酪乳杆菌Zhang的培养过程中，通过加入NaOH、KOH或氨水等中和剂和通氮气的方法，得到1011CFU/mL以上活菌数的干酪乳杆菌的冻干菌粉。Hayakawa K等人(J Ferment Bioeng,1990,70,404)采用膜技术与发酵罐偶联，不断过滤除去乳酸等胁迫成分，实现最高菌体密度高达1011CFU/mL，该方法需耗费大量培养基，且仅限于实验室水平，很难扩大到生产应用规模。
半固体或固体发酵体系中，中国发明专利(公开号：CN 105132321A)采用由麦麸和豆粕等物质组成的培养基，接种屎肠球菌进行固态发酵，干燥产品中的活菌含量最高为3.8×1010CFU/g。
类似的还有中国专利(公开号：CN 101555510B；CN 101555511B；CN 103421710B；CN 102907563B；CN 103289937B；CN 1212391C)均采用豆粕、麸皮、玉米芯、米糠、花生壳、淀粉、玉米粉、草炭等农业废弃物或农产品为主要成分的固体培养基，接种微生物，进行高密度发酵，产品中的活菌数基本为1011CFU/g。这类产品主要用于动物饲料或进行药物等代谢产物生产。
技术实现要素：
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种益生菌的高密度培养方法及其应用。
本发明采用的技术方案如下：
一、一种益生菌的高密度培养方法：
在含有促进益生菌生长繁殖的促生长因子的培养基中添加多孔材料，培养基与多孔材料的体积比为1：0.001–1：1000，再在培养基中接种益生菌并进行培养，实现益生菌高密度培养。
所述培养为厌氧培养，所接种的益生菌为厌氧或兼性厌氧的微生物。
厌氧培养是在30-42℃下培养12-48h。
培养结束后，所述益生菌聚集到多孔材料的表面或者内部或者表面和内部，得到干燥后的产品中总活菌数可达1011-1015CFU/g以上。活菌数受干燥方法等因素的影响，冷冻干燥的产品中活菌数更高。
所制备得到的益生菌具有良好的耐热性、耐酸性及耐药性等性能。
所述的培养基为液态、半固态或者固态，培养体系可为液体培养、半固体培养和固体培养三种培养方式中的任一种，所述的多孔材料为固态。
所述的培养基为YPD(酵母菌)、双歧杆菌培养基(青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、乳双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌)、MRS培养基(嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、瑞氏乳杆菌、约氏乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌双乙酰亚种、格氏乳杆菌、片球菌属、肠球菌属、魏斯氏菌属、蜜蜂球属、卷曲乳杆菌)、SIIM0012培养基(发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌)、M17培养基(嗜热链球菌)、乳酸菌培养基(乳酸乳球菌乳脂亚种)、肠膜明串珠菌培养基(肠膜明串珠菌肠膜亚种)、丙酸细菌培养基(丙酸杆菌属)、5oBé麦芽汁琼脂(德巴利酵母属、假丝酵母属、球拟酵母属)、血琼脂培养基(拟杆菌属、梭杆菌属)、番茄汁培养基(酒球菌属)、PDA马铃薯、葡萄糖琼脂培养基(青霉属)、SICC0070丁酸菌培养基(梭菌属)、TSA胰蛋白胨大豆琼脂(气球菌属)、肉汤培养基(芽孢杆菌属)、LB培养基(微球菌属)等。
所述的培养基中含有促进益生菌生长繁殖的促生长因子。含有促进益生菌生长繁殖的促生长因子如乳清发酵液、胶原蛋白发酵液、马铃薯发酵液、海藻提取物、菌菇类发酵液或提取物、豆乳、番茄汁、胡萝卜汁、玉米汁、冬虫夏草提取物、灵芝提取物、铁皮石斛提取物、当归提取物、银杏叶提取物、麦芽提取物、参类提取物、黄芪提取物、罗汉果提取物、菊粉、酵母葡聚糖、低聚木糖、维生素、氨基酸、多巴胺、植酸、黄腐酸、腐殖酸、镁盐、锌盐、锰盐、钙盐、铁盐、硒盐等的一种或多种。
所述的培养基中的多孔材料的平均孔径大小为1纳米-500微米，体积孔隙率为5％-99.9％(v/v)。5％-99.9％(v/v)指的是多孔材料中的孔隙占整个材料的体积比为5％-99.9％。
所述的多孔材料为凝胶材料、气凝胶材料、泡沫材料、纤维材料、微孔材料、介孔材料或者大孔材料等。
所述的凝胶材料、气凝胶材料、泡沫材料和纤维材料的平均孔径从纳米级尺寸到微米级尺寸不等；所述的微孔材料的平均孔径小于2纳米，介孔材料的平均孔径为2-50纳米，大孔材料的平均孔径大于50纳米。
所述的多孔材料为天然多糖类及其衍生物、天然蛋白类及其衍生物、合成高分子的均聚物或者共聚物、无机材料等材料中的一种或多种。
天然多糖类如甲壳素、壳聚糖、纤维素、木质素、葡聚糖、琼脂糖、低聚果糖、大豆低聚糖、魔芋葡甘聚糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、低聚麦芽糖、淀粉、糊精、菊粉、海藻酸及其盐、右旋糖酐、透明质酸、海藻多糖、褐藻多糖、螺旋藻多糖、地衣多糖、香菇多糖、灵芝多糖、银耳多糖、阿拉伯胶、果胶、瓜尔胶、黄原胶角叉菜胶等来源于植物、动物、海藻和微生物的多糖及其衍生物。
天然蛋白类如大豆蛋白、绿豆蛋白、小麦蛋白、玉米蛋白、谷蛋白、蚕丝蛋白、蜘蛛丝蛋白、胶原蛋白、乳清蛋白、明胶、酪蛋白酸钠、纤维蛋白、角蛋白等来源于植物、动物和微生物的蛋白及其衍生物。
合合成高分子的均聚物和共聚物如聚氨基酸、聚乙二醇、聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚己酸内酯、聚β羟基丁酸酯、聚β羟基戊酸等。
无机材料如珍珠岩、蒙脱土、炭黑、白炭黑、陶瓷等。
所述的多孔材料为以上所述材料的一种或多种，但又不局限于以上材料。
所用的益生菌为对人和(或)动物有益的微生物，如双歧杆菌属、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、乳双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、乳杆菌属、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种(保加利亚乳杆菌)、德氏乳杆菌亚种、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、链球菌属、嗜热链球菌、乳球菌属、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌双乙酰亚种、肠膜明串珠菌肠膜亚种、丙酸杆菌属、酵母属、德巴利酵母数、假丝酵母属、球拟酵母属、拟杆菌属、梭杆菌属、酒球菌属、消化链球菌属、青霉属、链球属、梭菌属、气球菌属、片球菌属、芽孢杆菌属、蜜蜂球菌属、肠球菌属、微球菌属、魏斯氏菌属等的一种或多种，但又不局限于以上菌种。
所述培养基中，多孔材料上接种的益生菌菌液量为0.1％-50％(v/v)。0.1％-50％(v/v)指的是益生菌菌液加入的体积量为加入后整个培养基体积的0.1％-50％。
所述益生菌接种菌液中的菌液的浓度是108-109CFU/mL。
依据本发明的培养方法培养，菌种在培养基中多组分的促进下，其生长繁殖速率大幅提升，培养结束后，干燥即可制得高密度益生菌产品。产品中的总活菌数可达1011-1015CFU/g以上，可用作益生菌发酵剂或益生菌制剂。这种高密度益生菌具有良好的耐热性、耐酸碱性及耐药性等性能。
二、所述益生菌在制备食品、食品添加剂、保健品、医药、饲料或者环保处理等产品中的应用。
所制备的益生菌在食品、医药、饲料、环保处理等领域有广阔的应用前景。
食品包括饼干、面包、蛋糕等西式糕点，米糕、馒头、包子、花卷、月饼、粽子等中式糕点，酸奶、乳制品等奶制品，水、果蔬汁、运动饮料等饮料，巧克力、蜜饯、面粉、面粉制品等。
保健品和医药包括粉剂和水剂制品。
饲料包括水产、宠物、猪、牛、羊、鸡、鸭等动物养育和养殖用饲料。
环保处理产品包括水处理、水净化等产品。
本发明的有益效果是：
本发明方法可实现益生菌的高密度培养，可直接加工制备成益生菌发酵剂或益生菌制剂。这种方法提高了益生菌生产的生产效率，减少了培养体积，有效降低生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
下面通过实施例，对本发明专利进一步的描述，但本发明并不限于这些。
本发明的实施例如下：
实施例1：
培养基中加入纤维素/壳聚糖凝胶，凝胶孔隙率为90％，平均孔径大小为500nm。该培养基中各组分重量百分比为MRS 75％，L-半胱氨酸盐酸盐1％，维生素C 1％，胡萝卜汁5％，香菇提取物10％，豆乳8％。培养基与多孔材料的体积比为1:0.2。
双歧杆菌接种到培养基中，双歧杆菌从中国工业微生物菌种保藏管理中心购得，双歧杆菌采用浓度为109CFU/mL的菌液，接种菌液量为20％。厌氧培养，37℃培养16h，干燥后产品中双歧杆菌总活菌数可达8×1011-3×1013CFU/g，活菌数受干燥方法等因素的影响，冷冻干燥的产品中活菌数更高。
实施例2：
培养基中加入胶原蛋白/海藻糖多孔膜，多孔膜孔隙率为80％，平均孔径大小为200nm。该培养基中各组分重量百分比为MRS 80％，蔗糖4％，镁盐1％，玉米汁5％，香菇提取物5％，乳清发酵液5％。培养基与多孔材料的体积比为1：1。
鼠李糖乳杆菌接种到培养基中，鼠李糖乳杆菌从中国工业微生物菌种保藏管理中心公众途径购买获得，鼠李糖乳杆菌采用浓度为109CFU/mL的菌液，接种菌液量为30％。37℃培养24h，干燥后产品中总活菌数可达2×1012-3×1014CFU/g，活菌数受干燥方法等因素的影响，冷冻干燥的产品中活菌数更高。
实施例3：
培养基中加入聚乳酸泡沫，泡沫孔隙率为92％，平均大小为400μm。该培养基中各组分重量百分比为YPD 85％，麦芽提取物4％，维生素1％，平菇提取物5％，灵芝提取物2％，胶原蛋白发酵液3％。培养基与多孔材料的体积比为1：500。
酵母接种到培养基中，酵母菌从中国工业微生物菌种保藏管理中心购得，酵母菌采用浓度为108CFU/mL的菌液，接种菌液量为50％。35℃培养24h，干燥后产品中总活菌数可达3×1012-2×1014CFU/g，活菌数受干燥方法等因素的影响，冷冻干燥的产品中活菌数更高。
实施例4：
培养基中加入蚕丝蛋白/低聚木糖纤维，纤维材料孔隙率为95％，平均孔径大小为5μm。该培养基中各组分重量百分比为M17 78％，马铃薯提取物10％，草菇发酵液5％，当归提取物5％，番茄汁2％。培养基与多孔材料的体积比为1:50。
植物乳杆菌接种到培养基中，植物乳杆菌从中国工业微生物菌种保藏管理中心公众途径购买获得，植物乳杆菌采用浓度为109CFU/mL的菌液，接种菌液量为45％。37℃培养36h，干燥后产品中总活菌数可达6×1011-7×1014CFU/g，活菌数受干燥方法等因素的影响，冷冻干燥的产品中活菌数更高。
实施例5：
培养基中加入珍珠岩和细菌纤维素颗粒，孔隙率为65％，孔径大小为0.2-20μm。该培养基中各组分重量百分比为MRS 78％，低聚木糖5％，海藻提取物5％，草菇发酵液5％，菊粉5％，植酸2％。培养基与多孔材料的体积比为1:0.01。
婴儿双歧杆菌、芽孢杆菌、瑞士乳杆菌混合接种到培养基中，上述菌种从中国工业微生物菌种保藏管理中心公众途径购买获得，均采用浓度为109CFU/mL的接种菌液，接种菌液量分别为15％,15％，15％。37℃培养36h，干燥后产品中总活菌数可达2×1013-1×1015CFU/g，活菌数受干燥方法等因素的影响，冷冻干燥的产品中活菌数更高。
实施例6：
培养基中加入细菌纤维素聚集体、胶原蛋白多孔膜和蒙脱土，孔隙率为70％，孔径大小为0.02-8μm。该培养基中各组分重量百分比为MRS 70％，豆乳8％，酵母葡聚糖5％，番茄汁5％，香菇发酵液5％，乳清发酵液5％，腐殖酸2％。培养基与多孔材料的体积比为1:100。
芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、丙酸杆菌、粪肠球菌混合接种到培养基中，上述菌种从中国工业微生物菌种保藏管理中心公众途径购买获得，均采用浓度为109CFU/mL的接种菌液，接种菌液量均为10％。37℃培养30h，干燥后产品中总活菌数可达4×1013-2×1015CFU/g，活菌数受干燥方法等因素的影响，冷冻干燥的产品中活菌数更高。
实施例7：
培养基中加入聚乳酸泡沫、葡聚糖凝胶颗粒和白炭黑，孔隙率为70％，平均孔径大小为0.2-300μm。该培养基中各组分重量百分比为MRS 50％，YPD20％，乳清发酵液10％，菊粉5％，酵母葡聚糖5％，胡萝卜汁5％，猴头菇发酵液3％，黄腐酸2％。培养基与多孔材料的体积比为1:10。
黄酒酵母、嗜热链球菌、德氏乳杆菌亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种、青春双歧杆菌、粪肠球菌混合接种到培养基中，上述菌种从中国工业微生物菌种保藏管理中心公众途径购买获得，酵母采用109CFU/mL的接种菌液，其它菌种均采用浓度为109CFU/mL的接种菌液，接种菌液量均为8％。37℃培养36h，干燥后产品中总活菌数可达8×1013-6×1015CFU/g，活菌数受干燥方法等因素的影响，冷冻干燥的产品中活菌数更高。
由上述实施例可见，本发明方法具有其突出显著的技术效果，能进行益生菌的高密度培养，提高了益生菌生产的生产效率，减少了培养体积，有效降低生产成本。