一种棉花抗黄萎病相关蛋白GaRPL18及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种棉花抗黄萎病相关蛋白GaRPL18及其编码基因与应用。
背景技术：
：棉花是世界上最重要的纤维作物，也是世界上最重要的油料作物之一，同时也是重要的战略物资。其生产、流通、加工和消费，均与人民群众的生活和广大棉农的利益以及国家的发展息息相关，对国民经济有着重要的影响。棉花黄萎病是棉花生产上最主要的两种病害之一，同时也是目前棉花届里的“癌症”，目前尚无有效的措施进行防治。而且棉花黄萎病在棉花整个生育期都可能发作，病菌在土壤中直接侵染根系，病菌穿过皮层细胞进入导管并在其中繁殖，产生的分生孢子及菌丝体堵塞导管，此外病菌产生的轮枝毒素也是致病重要因子，毒素是一种酸性糖蛋白，具有很强的致萎作用。并且其菌在土壤中存活时间非常长，极难处理；可以说棉花的黄萎病已经成为导致棉花产量损失的主要生物胁迫因素，对棉花生产的持续稳定发展构成严重威胁。为了应对黄萎病危害，多种手段并行，而在众多方法中转基因技术因其快速高效性渐渐被作为重点发展对象。转基因技术能够将快速、高效地将外源基因整合进入棉花的基因组，产生具有目标性状的转基因棉花，是产生高抗黄萎病品种的有效手段。因此，挖掘抗病相关基因成为转基因抗病育种的关键。GWAS(Genomewideanalysisstudy)作为一种联系表型与基因型之间的分析方法，已在控制作物(水稻、玉米、谷子、番茄、黄瓜、大豆中)的主要农艺性状的关键基因的定位中发挥着重要作用。中国亚洲棉作为亚洲棉六大地里种系之一，在长期的种植过程中经人工选择和分化形成了众多地方品种，具有一定的多样性，可以作为GWAS分析的群体。而中国亚洲棉在地理选择过程中关键基因受到选择，从而提高了植株抗病性，因此GWAS可以作为鉴定棉花抗病相关基因的强有力手段。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何调控植物对黄萎病的抗性。为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种棉花抗黄萎病相关蛋白。本发明所提供的棉花抗黄萎病相关蛋白的名称为GaRPL18蛋白质，所述GaRPL18蛋白质为如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；b)在序列3所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。其中，序列3由150个氨基酸残基组成。为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列3所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA分子或序列2所示的cDNA分子中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。为了解决上述技术问题，本发明还提供了与GaRPL18蛋白质相关的生物材料。本发明提供的与GaRPL18蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A12)中的任一种：A1)编码GaRPL18蛋白质的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：1)其编码序列是序列1所示的DNA分子或序列2所示的cDNA分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GaRPL18蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码GaRPL18蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列1由1211个核苷酸组成，序列2由453个核苷酸组成，均编码序列3所示的氨基酸序列。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GaRPL18蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与编码GaRPL18蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GaRPL18蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述生物材料中，A2)所述的含有编码GaRPL18蛋白质的核酸分子的表达盒(GaRPL18基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GaRPL18蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动GaRPL18转录的启动子，还可包括终止GaRPL18转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)。可用现有的表达载体构建含有所述GaRPL18基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。本发明提供了上述GaRPL18蛋白质或上述相关生物材料在如下a1)-a3)中任一种中的应用：a1)调控植物对黄萎病的抗性；a2)培育黄萎病抗性降低的转基因植物；a3)培育抗黄萎病的转基因植物。上述应用中，所述调控为提高或降低。为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育黄萎病抗性降低的转基因植物的方法。本发明提供培育黄萎病抗性降低的转基因植物的方法包括如下步骤：抑制受体植物中GaRPL18蛋白质表达，得到转基因植物；所述转基因植物对黄萎病的抗性低于受体植物。上述方法中，所述转基因植物对黄萎病的抗性低于受体植物体现在如下b1)或b2)：b1)转基因植物的感病率高于受体植物；b2)转基因植物的感病指数高于受体植物；所述抑制受体植物中GaRPL18蛋白质表达的方法为向所述受体植物中导入抑制GaRPL18蛋白质表达的物质；所述抑制GaRPL18蛋白质表达的物质为如下A)或B)或C)：A)序列表中序列12所示的DNA分子；B)含有所述A)的表达载体；C)B)所述载体和pCLCrVB载体；所述B)具体为将所示A)插入表达载体得到的重组载体。所述重组载体具体为pCLCrVA-GaRPL18载体，所述pCLCrVA-GaRPL18载体为将序列12所示的DNA片段替换pCLCrVA载体的SpeI和AscI酶切位点间的片段，且保持pCLCrVA载体的其他序列不变得到的载体。为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种具有如下B1)或B2)功能的产品：B1)降低植物对黄萎病的抗性；B2)培育黄萎病抗性降低的转基因植物。本发明提供的产品的活性成分为上述抑制GaRPL18蛋白质表达的物质。为了解决上述技术问题，本发明最后还提供了一种培育抗黄萎病的转基因植物的方法。本发明提供的培育抗黄萎病的转基因植物的方法包括在受体植物中过表达GaRPL18蛋白质，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物对黄萎病的抗性高于所述受体植物。上述方法中，所述转基因植物对黄萎病的抗性高于所述受体植物体现在如下c1)-c3)中任一种：c1)转基因植物的感病率低于受体植物；c2)转基因植物的感病指数低于受体植物；c3)转基因植物的发病时间晚于受体植物；所述过表达的方法为将GaRPL18蛋白质的编码基因导入受体植物。上述方法中，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列12所示的DNA分子。上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为棉花或拟南芥。本发明利用反转录PCR技术从棉花中克隆到了一个能产生60S核糖体蛋白的基因GaRPL18。通过实验证明：利用基因沉默技术获得的GaRPL18沉默棉花对致病菌(黄萎病菌(Vd-07038)的抵抗能力下降，而通过过表达方法获得的转GaRPL18基因拟南芥则表现出对致病菌(黄萎病菌(Vd-07038)的明显抗性。说明GaRPL18参与了棉花对病原菌及真菌的防御反应，是一种重要的参与棉花天然免疫反应的基因。以下结合附图及具体实施例进一步阐述本发明。附图说明图1是抗病棉花中GaRPL18基因受棉花黄萎病诱导上调表达示意图。图2是定量qPCR检测GaRPL18沉默棉花和转空载体棉花的基因沉默效率示意图。其中，CLCrV为转空载体棉花；CLCrV-GaRPL18-1、CLCrV-GaRPL18-2和CLCrV-GaRPL18-3均为GaRPL18沉默棉花。图3是GaRPL18沉默棉花和转空载体棉花的感病率示意图。其中，CLCrV为转空载体棉花；CLCrV-GaRPL18为GaRPL18沉默棉花。图4是GaRPL18沉默棉花和转空载体棉花的发病情况示意图。其中，CLCrV为转空载体棉花；CLCrV-GaRPL18为GaRPL18沉默棉花。图5是GaRPL18沉默棉花和转空载体棉花的感病指数示意图。其中，CLCrV为转空载体棉花；CLCrV-GaRPL18为GaRPL18沉默棉花。图6是接种黄萎病后转GaRPL18拟南芥(转基因)和野生型拟南芥(WT)的发病情况示意图。其中，WT为野生型拟南芥；转基因为阳性T3代转GaRPL18拟南芥。图7是接种黄萎病后转GaRPL18拟南芥(转基因)和野生型拟南芥(WT)的感病率示意图。其中，WT为野生型拟南芥；转基因为阳性T3代转GaRPL18拟南芥。图8是接种黄萎病后转GaRPL18拟南芥(转基因)和野生型拟南芥(WT)的病情指数示意图。其中，WT为野生型拟南芥；转基因为阳性T3代转GaRPL18拟南芥。图9是接种黄萎病后转GaRPL18拟南芥(转基因)和野生型拟南芥(WT)的整体莲座叶情况示意图。其中，WT为野生型拟南芥；转基因为阳性T3代转GaRPL18拟南芥。图10是接种黄萎病后转GaRPL18拟南芥(转基因)和野生型拟南芥(WT)的莲座叶台盼蓝染色情况示意图。其中，WT为野生型拟南芥；转基因为阳性T3代转GaRPL18拟南芥。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的pCLCrVA载体、pCLCrVB载体以及pCLCrVA-CHLI载体均在文献“ZhouhangGu,ChangjunHuang,FangfangLiandXuepingZhou(2014)，AversatilesystemforfunctionalanalysisofgenesandmicroRNAsincotton.PlantBiotechnologyjournal,12:638-649”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。下述实施例中的棉花黄萎病菌Vd07038在文献“Chu,J.,etal.,ComparativeanalysesofsecretedproteinsfromthephytopathogenicfungusVerticilliumdahliaeinresponsetonitrogenstarvation.BiochimBiophysActa,2015.1854(5):p.437-48.”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。下述实施例中的pCAMBIA3300载体是NTCC典型培养物保藏中心下属的BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心的产品，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。下述实施例中的农杆菌GV3101在文献“F.vanVliet，B.Silva，M.vanMontagu，J.Schell，TransferofRP4::MuplasmidstoAgrobacteriumtumefaciensPlasmid，1(4)：446-455”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。实施例1、棉花GaRPL18基因的克隆及表达模式分析一、GaRPL18基因的定位1、黄萎病研究群体的选择采用SSR标记引物对中国种系的500余份亚洲棉的多态性进行分析，根据分子标记结果选择215份能够代表中国亚洲棉群体的核心种质材料。2、亚洲棉群体基因型的获得采用QIAGEN(德国)公司的DNeasyPlantMiniKit试剂盒提取亚洲棉群体中各个个体的基因组DNA，建库，并进行5倍深度的重测序，采用GATAK软件进行群体SNP分析。3、群体黄萎病病情指数调查将黄萎病菌Vd07038接种于察氏培养基(NaNO3，2.0g；K2PO4，1.0g；KCl，0.5g；MgSO4·7H2O，0.5g；FeSO4，0.01g；蔗糖30.0g；用水定容至1L)中，在25℃，150rpm的条件下培养1周，稀释至107个孢子/每毫升，得到黄萎病菌孢子液，备用。采用蘸根法将黄萎病菌孢子液接种至种于蛭石和沙土中的2周大的棉花幼苗，发病期统计棉花的发病情况和病情指数。4、棉花抗病性GWAS分析采用TASSEL软件的GLM(Generallinearmodel)模型进行GWAS分析，其结果显示在Cotton_A_12318区域有很强的信号。因此从本地的亚洲棉基因组中提取Cotton_A_12318的蛋白序列，并采用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/)分析发现该蛋白为60S核糖体蛋白。二、GaRPL18基因全长的获得1、引物设计GaRPL18-F：TCTAGAATGAAGCTTTGGGCCACCAA(序列4)；GaRPL18-R：GGCGCGCCCATAAACAAGTTGGGTTT(序列5)。2、以抗病材料湖南常德铁子棉(由国家棉花种质资源中期库提供)的基因组DNA为模板，采用步骤1设计的引物进行PCR扩增，得到PCR产物。PCR扩增反应的反应体系(50μL)如下：5×PrimeSTARBuffer10μL，dNTPMixture4μL，GaRPL18-F(10μM)1μL，GaRPL18-R(10μM)1μL，GenomicDNA1μL，PrimeSTARHSTaq1μL，超纯水32μL。PCR反应条件如下：94℃5min；94℃30s，55℃70s，68℃45s，32个循环；68℃5min。3、将步骤2获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化，按照大连宝生物生命科技有限公司的pMD-19T-Simple(货号：D104A)试剂盒中提供的方案将凝胶纯化的扩增子克隆入T克隆载体中，并转化大肠杆菌DH5α中，在氨苄抗性的平板上筛选转化子，并进行菌落PCR，对阳性克隆进行单克隆测序。测序结果表明：PCR扩增得到大小为1211bp的条带，其核苷酸序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为GaRPL18基因。采用DNAMAN软件对获得的序列进行预测分析，发现该基因具有3个外显子，位置分别为1-49bp，122-193bp和868-1211bp。三、GaRPL18的cDNA中完整编码区(CDS)的获得1、引物设计GaRPL18-F：TCTAGAATGAAGCTTTGGGCCACCAA(序列4)；GaRPL18-R：GGCGCGCCCATAAACAAGTTGGGTTT(序列5)。2、以抗病材料湖南常德铁子棉的总RNA所合成的互补DNA(cDNA)为模板(cDNA获得方法具体参见大连宝生物公司的PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit(货号6210A)中的方法)，采用步骤1所设计的引物进行PCR扩增，得到PCR产物。PCR扩增反应的反应体系(50μL)如下：5×PrimeSTARBuffer10μL，dNTPMixture4μL，GaRPL18-F(10μM)1μL，GaRPL18-R(10μM)1μL，cDNA1μL，PrimeSTARHSTaq1μL，超纯水32μL。PCR反应条件如下：94℃5min；94℃30s，55℃40s，68℃45s，32个循环；68℃5min。3、将步骤2获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化，按照大连宝生物生命科技有限公司的pMD-19T-Simple(货号：D104A)试剂盒中提供的方案将凝胶纯化的扩增子克隆入T克隆载体中，并转化大肠杆菌DH5α中，在氨苄抗性的平板上筛选转化子，并进行菌落PCR，把阳性克隆进行单克隆测序。测序结果表明：PCR扩增得到大小为453bp的条带，其核苷酸序列如序列2所示，即为GaRPL18基因cDNA的CDS全长，终止密码子为TAG。采用在线网站GSDS2.0Server(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)对基因组结构进行了进一步分析，与DNAMAN预测结果一致。采用DNAMAN软件对获得的CDS序列进行蛋白序列预测，结果表明：GaRPL18基因编码的氨基酸序列如序列3所示，将其命名为GaRPL18蛋白。四、病菌侵染下GaRPL18的表达模式分析1、材料选择根据黄萎病病情指数的不同选取表1中的材料进行表达模式分析。其中，湖南常德铁子棉为黄萎病抗病材料(tolerancelines)，纳上区小花为黄萎病感病材料(susceptiblelines)。表1、黄萎病分析材料的信息DNA编号品种名称中期库编号生态型病情指数基因型GA0099湖南常德铁子棉M310220CJ3AGA0176纳上区小花M310313S45G2、引物设计定量PCR引物如下：QGaRPL18-F：AATGAAGTCCGTGCCAAATCCAAG(序列6)；QGaRPL18-R：CGGAGCCAAATGCCGTAGTTCTT(序列7)；Gahistone3-F：TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA(序列8)；Gahistone3-R：GCGCAAAGGTTGGTGTCTTC(序列9)。3、材料种子及接菌分别将表1中所示黄萎病感病材料纳上区小花和抗病材料湖南常德铁子棉的饱满种子种于营养钵中(蛭石：沙子体积比为3:2)，1周大定苗，每个营养钵中留5株，幼苗期(3片真叶)接种10ml黄萎病菌孢子液(黄萎病菌孢子液中孢子浓度为1×107/ml)，分别于接种后0h、6h、12h、24h、48h和72h取根部，速冻于液氮中，-80℃冰箱保藏备用。4、RNA提取及cDNA的合成采用液氮冷冻研磨样品，并采用植物多糖多酚总RNA(TIANGEN，北京，货号DP441)中的方法提取根部总RNA，随后采用大连宝生物公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser(货号RR047A)试剂盒合成cDNA，-20℃保藏备用。5、以步骤4中合成的cDNA为模板，采用步骤2中的引物，使用ABI7900定量PCR仪，进行定量PCR扩增，每个样品3个技术重复，以Gahistone3为内参基因，所有数据以0h为对照，采用2-△△CT法进行计算。PCR扩增体系如下：SYBRPremixExTaq(TliRNaseHPlus)(2×)10μL；QGaRPL18-F0.5μL；QGaRPL18-R0.5μL；ROXReferenceDyeII(50×)0.4μL；cDNA模板2μL；ddH2O6.8μL；SYBRPremixExTaq(TliRNaseHPlus)(2×)10μL；Gahistone3-F(内参):0.5μL；Gahistone3-R(内参):0.5μL；ROXReferenceDyeII(50×)0.4μL；cDNA模板2μL；ddH2O6.8μL；PCR条件如下：95℃30s，1个循环；95℃5s；60℃30s，40个循环。95℃15s；60℃30s；95℃15s；采用RQmanager2.1对获得的数据进行分析，结果如图1所示。从图1中可以看出：GaRPL18基因在黄萎病抗病材料湖南常德铁子棉(GA0099)中受到黄萎病菌的诱导而上调表达，并且其表达量在12h时达到顶峰，而黄萎病感病材料纳上区小花(GA0176)的表达量基本没有什么变化，说明感病材料中该基因不受黄萎病菌的诱导。该结果进一步验证GWAS定位的结果，说明GaRPL18与抗黄萎病相关。实施例2、GaRPL18沉默棉花的获得及其抗病分析一、重组载体及重组菌的构建1、CLCrV-GaRPL18载体的构建(1)引物设计：VGaRPL18-F：ACTAGTATGAAGCTTTGGGCCACCAA(序列10)；VGaRPL18-R：GGCGCGCCCATAAACAAGTTGGGTTT(序列11)。(2)以黄萎病抗病材料湖南常德铁子棉的cDNA为模板，以步骤(1)中设计引物来扩增获得目的片段，连接pMD-19T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆，并将其菌液测序。选择正确的克隆，提取质粒(pMD-19T-GaRPL18-V)。(3)采用限制性内切酶SpeI和AscI分别双酶切pMD-19T-GaRPL18-V和pCLCrVA载体，分别回收小片段和大片段，并采用T4连接酶过夜连接，得到pCLCrVA-GaRPL18载体。将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在卡那霉素培养基上筛选阳性克隆，采用菌落PCR验证并对其进行测序。测序结果表明：pCLCrVA-GaRPL18载体为将序列12所示的DNA片段替换pCLCrVA载体的SpeI和AscI酶切位点间的片段，且保持pCLCrVA载体的其他序列不变得到的载体。pCLCrVA-GaRPL18载体表达GaRPL18蛋白。2、侵染菌液的制备(1)重组菌的获得将步骤1获得的pCLCrVA-GaRPL18载体转化农杆菌GV3101，得到重组菌pCLCrVA-GaRPL18/GV3101。将pCLCrVA载体转化农杆菌GV3101，得到重组菌pCLCrVA/GV3101。将pCLCrVA-CHLI载体转化农杆菌GV3101，得到重组菌pCLCrVA-CHLI/GV3101。将pCLCrVB载体转化农杆菌GV3101，得到重组菌pCLCrVB/GV3101。上述pCLCrVA-GaRPL18/GV3101为实验组；pCLCrVA/GV3101为空载体对照；pCLCrVA-CHLI/GV3101为阳性对照，其中，阳性对照的表型是因为干涉棉花的镁螯合酶I亚族基因CHLI，影响叶绿素的合成，导致棉花叶片出现白化现象。(2)重组菌的培养分别将重组菌pCLCrVA/GV3101，pCLCrVA-GaRPL18/GV3101，pCLCrVA-CHLI/GV3101和pCLCrVB/GV3101接种于添加25μg/ml利福平，25μg/ml庆大霉素和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，28℃，180rpm培养至OD值为1.5-2.0；离心(5000rpm)收集上述菌体，并采用MMA溶液(10mMMES、10mMMgCl2、200μM乙酰丁香酮)重悬浮至OD600等于1.5，室温静置5h，分别得到培养后的重组菌。(3)侵染菌液的制备将培养后的重组菌pCLCrVA/GV3101与pCLCrVB/GV3101按照1:1的体积比混匀，得到混合菌液1；将培养后的重组菌pCLCrVA-GaRPL18/GV3101与pCLCrVB/GV3101按照1:1的体积比混匀，得到混合菌液2；将培养后的重组菌pCLCrVA-CHLI/GV3101与pCLCrVB/GV3101按照1:1的体积比混匀，得到混合菌液3。二、GaRPL18沉默棉花的获得及其抗病分析(一)GaRPL18基因在棉花抗黄萎病中的作用1、待侵染棉花幼苗的制备将饱满的抗黄萎病品种湖南常德铁子棉(GA0099)和感黄萎病品种纳上区小花(GA0176)(抗黄萎病品种GA0099和感黄萎病品种GA0176的种子均来自中国棉花种质资源库，其编号如表1所示)的种子播种于营养钵(蛭石与沙子的体积比为3:2)中，播种7天后定苗，每个营养钵留5株，23℃，16h光照/8h暗培养进行培养，作为待侵染棉花。其中，感病品种作为发病条件的对照植株。2、GaRPL18沉默棉花的获得及基因沉默效率检测分别将混合菌液1、混合菌液2和混合菌液3注射子叶刚平展期的待侵染棉花子叶的下表皮，暗培养24h后在25℃，16h光照/8h暗培养条件下进行培养，分别得到转空载体棉花(CLCrV)、GaRPL18沉默棉花(CLCrV-GaRPL18)和CHLI沉默棉花(阳性对照植株)。待阳性对照植株出现白化现象后，随机取转空载体棉花、GaRPL18沉默棉花和野生型抗黄萎病品种GA0099棉花的叶片，提取总RNA，并进行定量PCR检测基因沉默效率(GaRPL18沉默棉花中的GaRPL18基因相对表达量与转空载体棉花中的GaRPL18基因相对表达量的比值)。检测方法同实施例1步骤四。定量PCR检测基因沉默效率的结果如图2所示。从图2中可以看出：和转空载体棉花相比，GaRPL18沉默棉花(CLCrV-GaRPL18-1、CLCrV-GaRPL18-2、CLCrV-GaRPL18-3)中的GaRPL18基因表达量明显下降，说明GaRPL18基因被沉默，总的沉默效率在50％左右。3、黄萎病菌孢子液的制备用察氏培养基在35℃的恒温培养箱中培养黄萎病菌Vd07038，培养6～8天，等孢子数到1×107时停止培养，用四层纱布滤去菌丝，得到黄萎病菌孢子液。4、GaRPL18沉默棉花在抗黄萎病中的应用取黄萎病菌孢子液接种于生长至18天的转空载体棉花(CLCrV)、GaRPL18沉默棉花(CLCrV-GaRPL18)、野生型抗黄萎病品种GA0099棉花和阳性对照植株幼苗的根部(10ml/钵)。之后于不同的时间观察其表型变化，统计感病率和感病指数。病情指数＝[∑(各级病株数×相应病级)/(调查总株数×最高病级(4)]×100。其中，病情分级标准为：0级，健苗，无病状；1级，1～2片子叶表现病状，子叶变黄，真叶不显病状；2级，子叶和1片真叶表现病状；3级，2片真叶表现病状；4级，全部叶片表现病状，严重时叶片脱落，顶心枯死。感病率统计结果见图3，发病症状图见图4，感病指数变化情况见图5。从图中可以看出，和转空载体棉花相比，GaRPL18沉默棉花在接病后，感病率急速上升，并且发病程度明显重于转空载体棉花，感病指数也明显高于转空载体棉花。说明GaRPL18基因的沉默能显著降低棉花对黄萎病菌的抵抗能力，GaRPL18基因也与棉花抗黄萎病密切相关。野生型抗黄萎病品种GA0099棉花和转空载体棉花的检测结果无显著差异。实施例3、转GaRPL18拟南芥的获得及功能验证一、转GaRPL18拟南芥的获得1、构建超量表达载体(1)以抗病材料湖南常德铁子棉的总RNA所合成的互补DNA(cDNA)为模板，采用GaRPL18-F(序列4)和GaRPL18-R(序列5)为引物，扩增获得mRNA的编码区。并将其与pMD-19T载体连接，获得包含GaRPL18基因的中间载体(pMD-19T-GaRPL18)。(2)分别采用XbaI和AscI对中间载体和pCAMBIA3300载体进行双酶切，分别回收小片段(GaRPL18基因)和大片段(线性重组载体)，并采用T4连接酶于16℃水浴过夜连接，得到连接产物。采用冻融法将连接产物转化DH5α感受态细胞中，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上过夜培养形成单菌落。酶切体系(40μL)如下：10×CutSmart4μL，模板(中间载体/pCAMBIA3300)2mg，XbaI1μL，AscI1μL，补ddH2O至40μL。然后选取10个单菌落，在含有Kana的LB液体培养基中振荡培养，37℃过夜。之后进行PCR检测，并送公司测序，将测序正确的载体命名为pCAMBIA3300-GaRPL18。测序结果表明：pCAMBIA3300-GaRPL18重组载体为将序列12所示的DNA片段替换pCAMBIA3300载体的XbaI和AscI酶切位点间的片段，且保持pCAMBIA3300载体的其他序列不变得到的载体。pCAMBIA3300-GaRPL18载体超量表达GaRPL18蛋白。2、重组菌的获得采用冻融法将重组载体pCAMBIA3300-GaRPL18转化农杆菌GV3101中，得到重组菌pCAMBIA3300-GaRPL18/GV3101。将转化的农杆菌涂布在含庆大霉素、利福平和卡那霉素的LB固体平板上，于28℃暗培养。待平板长出馒头状菌落后进行菌落PCR(PCR鉴定的引物GaRPL18-F和GaRPL18-R，阳性克隆的产物大小为450bp)，挑选一个阳性单克隆进行扩大培养，随后将农杆菌保藏于甘油中放-80℃冰箱备用。菌落PCR体系如下：2×PCRMIX10μL；GaRPL18-F0.5μL；GaRPL18-R0.5μL；ddH2O8μL。PCR反应条件如下：95℃5min，一个循环；95℃5min，58℃30s，72℃40s，32个循环；72℃5min。3、转GaRPL18拟南芥的获得与筛选转化前3天，将甘油保藏的重组菌pCAMBIA3300-GaRPL18/GV3101加入新鲜的添加3抗(50μg/ml卡那霉素，25μg/ml利福平，25μg/ml庆大霉素)的LB液体培养基中进行活化。转化前1天晚上将新活化的菌按照1:1000的比例接种于新的LB培养基中。于28℃，200rpm培养至OD600＝1.2。5000rpm离心5min弃上清，向沉淀中加菌体悬浮液(MSI：25ml/L，MSⅡ5ml/L，Fe盐：5ml/L，B5V：5ml/L，蔗糖50g/L，灭菌后加入200μL/Lsilwet-77，调PH至5.7)悬浮至OD600＝0.8，得到待侵染菌液。将野生型拟南芥(Col-0)整个花序浸泡到待侵染菌液中45S，避光保存24h，隔一周待长出新花序后可再转化。待种子成熟后，收获种子，并干燥。然后将种子直播于营养土中，一周后对幼苗采用BASTA(1％)进行喷施，阴性植株将受到BASTA的毒害而枯死，阳性植株能够正常生长，继续种植，并按照实施例1中步骤四的方法对筛选的阳性植株的叶片进行表达量检测实验，直至得到阳性T3代转GaRPL18拟南芥纯合株系，选取表达量最高的株系作为实验材料用于下述抗黄萎病鉴定实验。二、转GaRPL18拟南芥的抗黄萎病鉴定1、感病率和感病指数将阳性T3代转GaRPL18拟南芥纯合株系种子(转基因)和野生型拟南芥种子(WT)播种于MS培养基中，生长两周后，转移至同一钵中，待苗总共长至20天时，接种10ml黄萎病菌孢子液(孢子浓度为1×107/ml)，观察并记录发病情况，统计感病率和感病指数，并观察莲座叶的生长情况。发病情况如图6所示，由图中可以看出：和野生型拟南芥植株(WT)相比，T3代转GaRPL18拟南芥植株的健康状况(转基因)明显好于野生型拟南芥植株(WT)。感病率和感病指数的统计结果如图7和图8所示，从图中可以看出，和T3代转GaRPL18拟南芥植株(转基因)相比，野生型拟南芥植株(WT)的感病率和感病指数均高于T3代转GaRPL18拟南芥植株(转基因)，且野生型拟南芥植株(WT)的发病时间提前、病情更重。莲座叶观察结果如图9所示，从图中可以看到：当野生型拟南芥(WT)叶边缘大范围的枯黄，多个叶片枯死时，T3代转GaRPL18拟南芥植株(转基因)则发病轻，生长状态好，说明T3代转GaRPL18拟南芥植株抗黄萎病能力较强。2、台盼蓝染色观察细胞死亡情况将阳性T3代转GaRPL18拟南芥纯合株系种子(转基因)和野生型拟南芥种子(WT)播种于MS培养基中，生长两周后，转移至同一钵中，待苗总共长至20天时，接种10ml实施例1步骤一的3中制备的黄萎病菌孢子液，并对阳性T3代转GaRPL18拟南芥植株和野生型拟南芥植株的相同部位的叶片进行台盼蓝染色，体视显微镜观察细胞死亡情况并拍照记录。台盼蓝染色的具体步骤如下：将拟南芥叶片浸泡在台盼蓝染液(台盼蓝染液配方：2.5g台盼蓝溶于1mL乳酚[25％(质量体积比)乳酸，23％(质量体积比)水溶苯酚，25％(质量体积比)甘油，其余是无菌水])中，沸水浴染色2min，自然冷却后室温染色过夜，后于1.25g/mL水合氯醛(250g水合氯醛用40mL蒸馏水溶解，定容至200mL)脱色3d，每天换一次脱色液。叶片台盼蓝染色结果如图10所示，由图可以看出相同部位的拟南芥莲座叶，野生型拟南芥(WT)叶片染色漂洗后颜色依然为深蓝色，而T3代转GaRPL18拟南芥叶片(转基因)通过漂洗只有叶脉为浅蓝色，说明野生型拟南芥的叶片已经有大量细胞死亡，而T3代转GaRPL18拟南芥叶片只有叶脉部位有细胞死亡，整体情况比较健康。通过下侧放大后的图像更能看出两者的差异，尤其是叶脉部位，通过对比叶脉部位可以看出经过黄萎病的侵染，野生型拟南芥(WT)叶片中大量细胞死亡，呈现出深蓝色，而T3代转GaRPL18拟南芥叶片(转基因)中只有少量细胞死亡，所以表现出浅蓝色。综上所述，转GaRPL18拟南芥具有较强的黄萎病抗性，可作为黄萎病作物育种的候选基因。当前第1页1 2 3