一种辣椒黑点炭疽病菌分子检测引物及检测方法与流程

本发明涉及一种辣椒黑点炭疽病菌分子检测引物及其检测方法，专用于辣椒黑点炭疽病菌的快速分子检测，同时可实现田间辣椒黑点炭疽病菌的早期诊断和病菌的监测鉴定，属于农作物病害检测和生物技术领域。

背景技术：

辣椒为茄科辣椒属(Capsicum)一年生草本植物，是重要的蔬菜及调味品，原产南美，现世界各国栽培较为普遍，在我国已有数百年栽培历史。辣椒营养丰富，辣椒中的维生素种类和含量丰富，一颗辣椒中，含有维生素 A、B、C、E、K、胡萝卜素和叶酸等，还含有钙和铁等矿物质以及膳食纤维。辣椒中维生素 C 含量在蔬菜中居第一位，辣椒果实含有辣椒素而有辣味，可增进食欲。辣椒现分布全国各地，华北、西北南部为主要产地。是我国主要的蔬菜品种之一。

炭疽病是辣椒的主要病害之一，对辣椒果实产量和品质影响很大，严重时可致绝收。辣椒炭疽病主要危害叶片和果实。初呈水浸状黄褐色圆斑，进而发展为中央灰褐色，有同心轮纹，上生小黑点的圆型或不规则型病斑，干燥时呈现膜状且易破裂。病菌侵染叶片时，初期病斑呈褪绿呈水渍状，慢慢扩大，病斑中间灰白色，周围褐色。在果实上，病斑表面初生为水渍状，逐渐扩展为褐色凹陷，圆形或不规则形状，病斑上生有黑点，为病原菌分生孢子。受害的辣椒茎病部呈不规则或梭形病斑，纵裂凹陷。辣椒炭疽病病菌以菌丝体在被害植株内越冬，或以拟菌核随病残体在土中越冬，种子带病菌也成为重要的侵染来源。带病种子可远距离传播，病斑上病菌可借雨水、露水传染。在我国辣椒种植地区辣椒炭疽病每年均有不同程度的发生，一旦发病当年就会造成10%-30%的损失，如果防治不力，次年就可能造成绝收毁园，给辣椒生产造成极大威胁。辣椒黑点炭疽病菌在田间主要通过风雨传播，雨水飞溅是近距离传播的主要因子，而病害初发期是病害防治的最佳时期。因此，建立一种快速、灵敏的检测方法用于辣椒炭疽病的早期诊断，为病害的最佳防治时期提供技术支撑。目前以症状为基础的病害常规诊断技术，需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤，耗时长、效率低、准确性差，难以做到病害发生时及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行，难以满足辣椒炭疽病诊断的实际需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、结果可靠、灵敏度高的快速诊断技术。

近年来，分子生物学技术发展迅速，随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，其中PCR（polymerase chain reaction）技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断。真菌核糖体转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计特异性引物进行PCR，对病原菌进行快速检测和鉴定的技术已受到广泛的应用，国内外研究人员已成功开发出大豆疫霉、辣椒疫霉、柑橘溃疡病菌、甘薯黑斑病菌和玉米南方锈病菌等多种病原菌的特异性引物和检测方法，实现了快速、灵敏和准确的鉴定。但目前有关辣椒黑点炭疽病菌分子检测的研究尚未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术中对辣椒炭疽病的识别主要基于病斑的形态特征，对辣椒病原菌的检测和鉴定主要基于病原形态学特征，程序繁琐、耗死长、对鉴定经验要求高、准确度低，难以满足辣椒炭疽病诊断的实际需要问题，提供了一种辣椒黑点炭疽病菌分子检测引物及其检测方法。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

本发明首先提供了一种辣椒黑点炭疽病菌分子检测引物，其核苷酸序列为：

上游引物CAF：5’-CTATAACTGTTGCTTCGGCGG-3’；

下游引物CAR：5’-TCCCAGTGCGAGACGTAAAG-3’。

所述引物CAF和CAR对辣椒黑点炭疽病菌特异性扩增出406bp的产物。

本发明还提供了一种辣椒黑点炭疽病菌的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)从辣椒叶片或辣椒果实中提取DNA；

用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA；用于检测辣椒叶片或果实组织是否存在辣椒黑点炭疽病菌时，采用NaOH 快速裂解法提取辣椒组织基因组DNA。

(2) 以提取辣椒叶片或辣椒果实DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的CAF和CAR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出406bp的产物，则可判定所述的辣椒叶片或辣椒果实中存在辣椒黑点炭疽病菌，否则所述的辣椒叶片或辣椒果实中不存在辣椒黑点炭疽病菌。

本发明的积极有益效果在于：

（1）准确性高：本发明是根据真菌核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对辣椒黑点炭疽病菌具有特异扩增作用的PCR 引物。已经对不同地理来源的辣椒黑点炭疽病菌、携带辣椒黑点炭疽病菌的植物叶片、携带辣椒黑点炭疽病菌的果实和健康的辣椒组织进行了检测验证，只有辣椒黑点炭疽病菌和携带该病菌叶片和果实中能特异性地扩增出一条406 bp 的电泳条带，说明本发明所设计的引物用于检测辣椒黑点炭疽病菌准确可靠；

（2）特异性强：本发明所设计的引物对辣椒黑点炭疽病菌具有很强的特异性，能够用于区别早疫病菌（Alternaria sdani）、辣椒褐斑病菌（Cercospora capsici）、辣椒疫霉病菌（Botrytis cinerea）及辣椒灰霉病菌(Phytophthora capsici)等辣椒上常见的病原菌，从而能有效区分发生在辣椒上症状特征相似的病害；

（3）灵敏度高：本发明将设计的特异引物与ITS 基因通用引物（ITS1/ITS4）联合起来进行巢式PCR 扩增后，对辣椒黑点炭疽病菌的检测灵敏度在DNA 水平上可达到1fg；

（4）适用性广、实用性好：本发明的辣椒黑点炭疽病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的辣椒果实和叶片进行检测，可实现辣椒黑点炭疽病菌的早期检测，即在病害显症前进行检测，防治病害的爆发流行。

（5）操作简便快速：本发明只需进行DNA 提取、PCR 扩增和琼脂糖电泳后即可判定结果，一般整个检测过程可在数小时内完成，操作简便快捷。

附图说明

图1为本发明引物对辣椒黑点炭疽病菌特异性扩增电泳图：其中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道2、泳道3为辣椒黑点炭疽病菌，泳道4-10分别为：辣椒早疫病菌（Alternaria sdani）、辣椒褐斑病菌（Cercospora capsici）、辣椒疫霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒灰霉病菌(Phytophthora capsici)、辣椒立枯病菌（Rhizoctonia solani）、番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)、阴性对照。

图2为本发明引物辣椒黑点炭疽病菌的灵敏性检测扩增电泳图：图A：普通PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道2-12分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、阴性对照、阳性对照; 图B为巢式PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道2-13分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、阴性对照、阳性对照。

图3为本发明辣椒发病果实和叶片扩增电泳图，其中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道2-10分别为自然发病的辣椒叶片、自然发病的辣椒果实、人工接种发病的辣椒叶片、人工接种发病初期的辣椒果实、健康的辣椒叶片、健康的辣椒果实、健康的辣椒果柄、阴性对照、阳性对照。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 分子检测引物设计及辣椒黑点炭疽病菌特异分子检测方法的建立

1.辣椒黑点炭疽病菌基因组DNA的提取：

采用 CTAB 法提取本实验室保存的2株辣椒黑点炭疽病菌的基因组 DNA，具体步骤如下：

(1)取0.1 g菌丝粉于1.5 mL 离心管中，加入900 μL2%CTAB提取液，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴60min，室温条件下，12000r/min离心15 min；

(2)取上清液700 μL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（各体积比为25:24:1），温和摇动，室温条件下，8000 r/min离心10min ；

(3)取上清液500 μL，加入等体积氯仿再抽提一次，室温条件下，8000 r/min离心10min；

(4)取上清液350 μL，加入1/10 体积3 mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀60 min，4℃条件下，8000 r/min离心5 min ；

(5)弃去上清液，加入700μL 体积浓度为70%冰乙醇，轻摇10sec，4℃条件下，8000 r/min离心10sec，晾干，加入50 μL TE缓冲液，-20℃保存备用。

2.辣椒黑点炭疽病菌ITS序列测定：

以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 为引物对提取辣椒黑点炭疽病菌的DNA 进行PCR 扩增，扩增反应体系和反应程序为：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶（Takara 大连宝生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10min；所得PCR产物送大连宝生物工程有限公司测序。

3.辣椒黑点炭疽病菌特异分子检测引物的设计：

根据辣椒黑点炭疽病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种间高度变异和种内稳定性，用Clustal X软件将测序得到的2 株辣椒黑点炭疽病菌的ITS 序列与GenBank 中Colletotrichum属不同种的ITS序列、辣椒早疫病菌（Alternaria sdani）ITS 序列、辣椒褐斑病菌（Cercospora capsici）ITS 序列、辣椒疫霉病菌（Botrytis cinerea）ITS 序列、辣椒灰霉病菌(Phytophthora capsici) ITS 序列、辣椒立枯病菌（Rhizoctonia solani）ITS 序列、番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)ITS 序列进行同源性分析和差异位点比较，用Primer Primer5软件设计了对辣椒黑点炭疽病菌具有特异性扩增作用的一对PCR引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，即特异分子检测引物的序列为：

上游引物CAF：5’-CTATAACTGTTGCTTCGGCGG-3’；

下游引物CAR：5’-TCCCAGTGCGAGACGTAAAG-3’

4.辣椒黑点炭疽病菌快速分子检测方法的建立：

(1)从辣椒叶片或辣椒果实中提取DNA:

①用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA;

②用于检测辣椒植株组织是否感染辣椒黑点炭疽病菌时，采用NaOH 快速裂解法提取辣椒植株组织基因组DNA，具体步骤如下：

a.称取待检测的植物组织0.1 g，加入0.5 mol/L NaOH 30 μL，将组织充分磨碎成糊；

b.将糊状组织转入1.5 mL 离心管中，12000r/min 离心6 min，取上清液5 μl ；

c.上清液中加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），混合均匀，取1.0 μL 作为PCR 模板进行扩增；

(2) 以提取辣椒叶片或辣椒果实DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的CAF和CAR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出406bp的产物，则可判定所述的辣椒叶片或辣椒果实中存在辣椒黑点炭疽病菌，否则所述的辣椒叶片或辣椒果实中不存在辣椒黑点炭疽病菌。

实施例2 辣椒黑点炭疽病菌特异性扩增

1.采用CTAB 法提取2株辣椒黑点炭疽病菌、辣椒早疫病菌（Alternaria sdani）、辣椒褐斑病菌（Cercospora capsici）、辣椒疫霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒灰霉病菌(Phytophthora capsici)、辣椒立枯病菌（Rhizoctonia solani）、番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)的基因组DNA。

2. 以提取供试菌的DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的CAF和CAR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

3.特异性扩增结果

如图1所示，2株辣椒黑点炭疽病菌可以特异性扩增出406bp的条带，而辣椒早疫病菌（Alternaria sdani）、辣椒褐斑病菌（Cercospora capsici）、辣椒疫霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒灰霉病菌(Phytophthora capsici)、辣椒立枯病菌（Rhizoctonia solani）、番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)和阴性对照均无扩增条带，表明本发明的分子检测引物可以将辣椒黑点炭疽病菌与其他病原菌区分开来，具有很强的特异性，本发明的检测方法可用于辣椒黑点炭疽病菌的特异性扩增。

实施例3本发明引物对辣椒黑点炭疽病菌的灵敏性检测

1.采用CTAB 法提取辣椒黑点炭疽病菌的基因组DNA；

2.将提取的辣椒黑点炭疽病菌的基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，用无菌超纯水稀释，配制成系列浓度，备用；

3. 以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的CAF和CAR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

4. 以配制的成系列浓度DNA为模板进行巢式PCR扩增：

（1）第一轮PCR 扩增：以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3' 为外引物对配制的成系列浓度DNA 进行第一轮PCR 扩增，扩增反应体系和反应程序为：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶（Takara 大连宝生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10min；

（2）第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增的产物为模板，以CAF/CAR为引物进行第二轮PCR扩增，PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的CAF和CAR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共30个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

5.检测结果

如图2所示，以本发明引物CAF/CAR为引物进行常规PCR时，在25μL反应体系中，10pg的辣椒黑点炭疽病菌DNA可以获得可视条带，其检测灵敏度可达到10pg（图2-A）；而进一步以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS）的通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 为外引物扩增的产物为模板，以本发明引物CAF/CAR为引物进行第二轮扩增时，在25μL反应体系中，1fg的辣椒黑点炭疽病菌DNA可以获得可视条带，其检测灵敏度可达到1fg(图2-B)。

实施例4辣椒叶片及辣椒果实中辣椒黑点炭疽病菌的检测

1.采用NaOH 快速裂解法提取辣椒植株组织基因组DNA。

2. 以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的CAF和CAR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

3. 检测结果

如图3所示，自然发病的辣椒叶片、自然发病的辣椒果实、人工接种发病的辣椒叶片、人工接种发病初期辣椒果实、阳性对照中均可产生406bp左右的可视条带，而健康的辣椒叶片、健康的辣椒果实、健康的辣椒果柄、阴性对照均无任何条带出现，表明本发明引物和检测方法还可用于田间辣椒炭疽病的检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种辣椒黑点炭疽病菌分子检测引物及检测方法

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