本发明涉及烟用添加剂领域，具体涉及利用固定化醋酸菌制备烟用月桂提取物的制备方法。
背景技术：
加香加料是卷烟工艺中的关键环节，是完善产品风格的决定因素和提高卷烟香气质量的有效手段之一。目前烟用香精香料主要还是通过对天然动植物的提取、化学合成制备。由于受到天然植物资源有限以及化学合成条件较苛刻限制。随着生物技术的发展，近年来，利用微生物发酵法制备烟用香原料，为烟用香原料的生产提供一条经济、高效的途径，开发一些传统方法无法生产的新型烟用香原料。
微生物固定化技术，是将特选的微生物固定在选证的载体上，使其高度密集并保持生物活性，在适应条件下能够快速、大量增殖的生物技术，能够弥补悬浮微生物发酵处理效率低、固液分离困难、抗毒性差等缺点。因此，近年来，微生物固定化技术的研究非常活跃，发展较快，已应用到许多工业部门如食品发酵工业，环境保护，新能源开发以及生物传感器等，并取得了深入发展，显示出了强大的优越性。主要涉及到以下几个方面：在食品发酵工业中用于生产乙醇、啤酒、酸奶等；在环境保护中用于环境监测和工业废水的处理；在新能源开发中用于生产氢气、甲烷、生化电池、微生物电池等；固定化微生物还可作为分子识别元件，用于制作各种生物传感器。而随着固定微生物技术的不断成熟、完善，逐渐向高效低能耗、低成本、简单化、安全自动化、无污染等方向发展，在能源危机、资源短缺、环境污染日趋严重的情况下，由此将推动其在废水处理方面更加深入和广泛的应用，具有更加深远的意义。尤其在废水处理方面，具有很大的应用前景。但在利用微生物固定化技术制备烟用月桂提取物却未见报道。
月桂(学名：laurusnobilis)，樟科月桂属小乔木或灌木植物。月桂原产于地中海一带，中国浙江、江苏、福建、四川、云南等地有引种栽培。以月桂为原料的月桂浸膏、月桂提取物、月桂精油等在卷烟中应用广泛，具有丰富烟香、增加卷烟香气透发性，柔和细腻烟气的作用。
醋酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量醋酸等有机酸细菌的通称，醋酸菌广泛应用于食醋、果醋等酿造行业中，但在烟用天然香料的制备中却很少报道。醋酸菌在发酵过程中产生大量有机酸，这些有机酸在卷烟中具有降低刺激性和柔和细腻烟气的作用，同时，还能赋予卷烟特征的酸香风格，因此，醋酸菌发酵在提升烟用天然香料的品质方面具有良好的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种固定化醋酸菌制备烟用月桂提取物的方法，采用固定化醋酸菌发酵技术，开发了一种新型的月桂提取物，该提取物可以在卷烟中使用，能够丰富烟香，提升卷烟香气质量，增加酸香香韵，增加卷烟香气透发性，柔和细腻烟气，降低刺激性，掩盖杂气，改善余味，改善喉部舒适性。
本发明提供一种固定化醋酸菌制备烟用月桂提取物的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
(1)取月桂根叶，加入其重量2～5倍的水，浸泡12～24h，在95～100℃下回流提取2～3次，每次提取时间为2～3小时，提取完后冷却至室温，并过滤得到提取液，合并多次提取液，得到月桂提取物a；
(2)将醋酸菌接种到肉汤培养基中，在温度37℃、搅拌转速为50rpm的条件下培养48小时，取培养液于8000rpm下离心，离心后的湿菌体备用；
(3)醋酸菌的聚乙烯醇—海藻酸钠固定化：采用聚乙烯醇水溶液与海藻酸钠水溶液配制含质量百分比6％～10％的聚乙烯醇和质量百分比1％～3％的海藻酸钠的混合溶液，然后向混合溶液中加入总溶液体积的2～5％的步骤(2)中制备的醋酸菌湿菌体，配制成混合液，用蠕动泵经过1～5mm孔径的针头将配制好的混合液逐滴加入到cacl2的质量百分比为1～3％的硼酸饱和溶液中，交联1h形成小球，然后将小球取出再加入饱和na2so4溶液中交联3-5h，得pva-sa固定化醋酸菌小球，最后采用无菌水冲洗，烘干备用；
(4)将步骤(1)中制备的月桂提取物a与步骤(3)中制备的固定化醋酸菌小球按照质量比5～10:1混合，在温度为30～37℃，搅拌转速为1～5rpm的条件下发酵3～7d，然后置于4℃冷柜中保存7～14d；
(5)取步骤(4)中冷藏后的发酵液，加入其质量2～4倍的80～95％酒精溶液，沉淀24～48小时，过滤取上清液在压力为0.1mpa，温度为45℃的条件下浓缩至相对密度为1.25～1.30，得月桂提取物b；
(6)将步骤(5)的月桂提取物b，加入丙二醇，在压力0.1～10pa，进料温度为50℃～65℃，进料速度为5～50ml/min，刮板转速为120～180rpm的条件下进行分子蒸馏，取轻组分为月桂提取物；其中丙二醇的加入量占分子蒸馏物总质量的百分比为10％～30％。
本发明中采用的醋酸菌为醋化醋杆菌(acetobacteraceti)pdh2.05，于2016年8月29日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2016436。
本发明采用的微生物固定化技术具有发酵处理效率高、固液分离容易、抗毒性强等优点，能够弥补传统生物工艺的不足。
本发明以月桂根为原料，利用固定化醋酸菌发酵月桂提取物，获得了一种品质优良的烟用月桂提取物，该提取物在卷烟中具有丰富烟香，提升卷烟香气质量，增加卷烟香气透发性，柔和细腻烟气，降低刺激性，掩盖杂气，改善余味，改善喉部舒适性等作用，同时还赋予卷烟特色的酸香风格；与悬浮醋酸菌发酵相比，该方法制备的月桂提取物有机酸含量增加了2.15％～5.68％，卷烟效果评价中，口腔余味更加舒适，香气更加丰富。该方法替代了月桂提取物传统的提取技术，更新了生物发酵制备工艺，使得其能够在卷烟中适用性增加，对烟用月桂提取物的制备提供了一条新途径。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细的描述。
本发明中采用的醋酸菌为醋化醋杆菌(acetobacteraceti)pdh2.05，于2016年8月29日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2016436。
本发明以下实施例中的pva-sa(聚乙烯醇-海藻酸钠)固定化醋酸菌小球是按照以下方法采用聚乙烯醇(pva)和海藻酸钠(sa)对醋酸菌进行固定化得到的：
(1)将醋酸菌接种到肉汤培养基中，在温度37℃、搅拌转速为50rpm的条件下培养48小时，取培养液于8000rpm下离心，离心后的湿菌体备用；上述方法中肉汤培养基为常用的普通肉汤培养基，其具体配方为(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，最终ph7.3±0.1；
(2)醋酸菌的聚乙烯醇—海藻酸钠固定化：采用聚乙烯醇水溶液与海藻酸钠水溶液配制含质量百分比6％-10％的聚乙烯醇和质量百分比1％-3％的海藻酸钠的混合溶液，然后向混合溶液中加入总溶液体积的2-5％的步骤(2)中制备的醋酸菌湿菌体，配制成混合液，用蠕动泵经过1-5mm孔径的针头将配制好的混合液逐滴加入到cacl2的质量百分比为1-3％的硼酸饱和溶液中，交联1h形成小球，然后将小球取出再加入饱和na2so4溶液中交联3-5h，得pva-sa固定化醋酸菌小球，最后采用无菌水冲洗，烘干备用；所述含有1-3％cacl2的硼酸饱和溶液的量和饱和na2so4溶液的量并无特殊要求，含有1-3％cacl2的硼酸饱和溶液只需要能够使混合液产生沉淀，满足醋酸菌的固定化要求即可，na2so4溶液的只需要将小球完全浸泡便可；所述硼酸饱和溶液和饱和na2so4溶液均为饱和水溶液。
实施例1，一种固定化醋酸菌制备烟用月桂提取物的方法，包括以下步骤：
(1)将月桂叶粉碎，加入其重量5倍的水浸泡12小时，然后在100℃下回流提取2次，每次提取时间为3小时，提取完后冷却至室温，并过滤得到提取液，合并两次提取液，得到月桂提取物a，两次提取的条件完全相同；
(2)将步骤(1)中制备的月桂提取物a与上述方法制备的pva-sa固定化醋酸菌小球按照质量比5:1混合，在温度为30℃，搅拌转速为5rpm的条件下发酵4d，然后置于4℃冷柜中保存7d；
(3)将步骤(2)发酵冷藏静置后发酵液过滤，得澄清发酵液，加入其质量3倍的95％酒精溶液，沉淀24小时，过滤取上清液在压力为0.1mpa，温度为45℃的条件下浓缩至相对密度为1.25，得月桂提取物b；
(4)取步骤(3)中制备的月桂提取物b，加入丙二醇，在压力0.1～10pa，进料温度为50℃～65℃，进料速度为5～50ml/min，刮板转速为120～180rpm的条件下进行分子蒸馏，取轻组分为月桂提取物；其中丙二醇的加入量占分子蒸馏物总质量的百分比为20％。
实施例1中制备的月桂提取物在卷烟中具有丰富烟香，提升卷烟香气质量，增加酸香香韵，增加卷烟香气透发性，柔和细腻烟气，降低刺激性，掩盖杂气，改善余味，改善喉部舒适性。
实施例2，一种固定化醋酸菌制备烟用月桂提取物的方法，包括以下步骤：
(1)将月桂叶粉碎，加入其重量3倍的水浸泡24小时，在98℃下回流提取3次，每次提取时间为2小时，提取完后冷却至室温，并过滤得到提取液，合并三次提取液，得到月桂提取物a；三次提取的条件完全相同；
(2)将步骤(1)中制备的月桂提取物a与制备的固定上述方法中制备的化醋酸菌小球按照质量比8:1混合，在温度为35℃，搅拌转速为3rpm的条件下发酵5d，，然后置于4℃冷柜中保存10d；
(3)将步骤(3)发酵后发酵液过滤，得澄清发酵液，加入其质量4倍的80％酒精溶液，沉淀48小时，过滤取上清液在压力为0.1mpa，温度为45℃的条件下浓缩至相对密度为1.30，得月桂提取物b；
(4)取步骤(3)中制备的月桂提取物b，加入丙二醇，在压力0.1～10pa，进料温度为50℃～65℃，进料速度为5～50ml/min，刮板转速为120～180rpm的条件下进行分子蒸馏，取轻组分为月桂提取物；其中丙二醇的加入量占分子蒸馏物总质量的百分比为30％。
实施例2中制备的月桂提取物具有丰富烟香，提升卷烟香气质量，增加酸香香韵，增加卷烟香气透发性，柔和细腻烟气，降低刺激性，掩盖杂气，改善余味，改善喉部舒适性。
实施例3，一种固定化醋酸菌制备烟用月桂提取物的方法，包括以下步骤：
(1)将月桂叶粉碎，加入其重量2倍的水浸泡20小时，在95℃下回流提取3次，每次提取时间为3小时，提取完后冷却至室温，并过滤得到提取液，合并三次提取液，得到月桂提取物a；三次提取条件完全相同；
(2)将步骤(1)中的月桂提取物a与上述方法制备的固定化醋酸菌小球按照质量比10:1混合，在温度为36℃，搅拌转速为4rpm的条件下发酵7，，然后置于4℃冷柜中保存14d；
(3)将步骤(2)发酵后发酵液过滤，得澄清发酵液，加入其质量2倍的95％酒精溶液，沉淀48小时，过滤取上清液在压力为0.1mpa，温度为45℃的条件下浓缩至相对密度为1.15，得月桂提取物b；
(4)取步骤(3)中制备的月桂提取物b，加入丙二醇，在压力0.1～10pa，进料温度为50℃～65℃，进料速度为5～50ml/min，刮板转速为120～180rpm的条件下进行分子蒸馏，取轻组分为月桂提取物；其中丙二醇的加入量占分子蒸馏物总质量的百分比为40％。
实施例3中制备的月桂提取物具有丰富烟香，提升卷烟香气质量，增加酸香香韵，增加卷烟香气透发性，柔和细腻烟气，降低刺激性，掩盖杂气，改善余味，改善喉部舒适性。
对比实验，申请人将本发明制备的月桂提取物与现有传统提取方法制备的月桂提取物、采用悬浮醋酸菌发酵制备的月桂提取物按照正常加香方式添加到烟丝中，制成卷烟，并进行评吸，其评吸效果如下：
三种不同工艺制备的月桂提取在卷烟中的感官评价效果比较
从上述对比实验可以看出来，本发明中制备的月桂提取物添加到卷烟中效果更好，而且根据具体实验分析发现，与悬浮醋酸菌发酵相比，该方法制备的月桂提取物有机酸含量增加了2.15％～5.68％，卷烟效果评价中，口腔余味更加舒适，香气更加丰富。