本发明涉及烟用添加剂领域，具体涉及利用固定化酵母菌制备烟用橙花提取物的制备方法。
背景技术：
加香加料是卷烟工艺中的关键环节，是完善产品风格的决定因素和提高卷烟香气质量的有效手段之一。目前烟用香精香料主要还是通过对天然动植物的提取、化学合成制备。由于受到天然植物资源有限以及化学合成条件较苛刻限制。随着生物技术的发展，近年来，利用微生物发酵法制备烟用香原料，为烟用香原料的生产提供一条经济、高效的途径，开发一些传统方法无法生产的新型烟用香原料。
微生物固定化技术，是将特选的微生物固定在选证的载体上，使其高度密集并保持生物活性，在适应条件下能够快速、大量增殖的生物技术，能够弥补悬浮微生物发酵处理效率低、固液分离困难、抗毒性差等缺点。因此，近年来，微生物固定化技术的研究非常活跃，发展较快，已应用到许多工业部门如食品发酵工业，环境保护，新能源开发以及生物传感器等，并取得了深入发展，显示出了强大的优越性。主要涉及到以下几个方面：在食品发酵工业中用于生产乙醇、啤酒、酸奶等；在环境保护中用于环境监测和工业废水的处理；在新能源开发中用于生产氢气、甲烷、生化电池、微生物电池等；固定化微生物还可作为分子识别元件，用于制作各种生物传感器。而随着固定微生物技术的不断成熟、完善，逐渐向高效低能耗、低成本、简单化、安全自动化、无污染等方向发展，在能源危机、资源短缺、环境污染日趋严重的情况下，由此将推动其在废水处理方面更加深入和广泛的应用，具有更加深远的意义。尤其在废水处理方面，具有很大的应用前景。但在利用微生物固定化技术制备烟用橙花提取物却未见报道。
橙花是苦橙的白色花瓣，芸香科柑橘属植物，原产于法国南部、摩洛哥、埃及和意大利等地。以橙花为原料的香料橙花精油和橙花净油是卷烟中常用的烟用添加剂，在卷烟中具有丰富烟香、增加花香和甜香香韵的作用。
酵母菌是一些单细胞真菌，是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称，一般泛指能发酵糖类的真菌，可用于酿造生产，该菌在发酵过程中能产生乙酸乙酯、苯乙醇等香气物质，这些香气物质能够赋予卷烟特征的甜香香气，是一种生产烟用香料的优质产香菌。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种固定化酵母菌制备烟用橙花提取物的方法，结合微生物固定化发酵、冷冻干燥和分子蒸馏等技术，开发了一种新型烟用橙花提取物。
本发明提供的技术方案：所述一种固定化酵母菌制备烟用橙花提取物的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
(1)取橙花，加入其重量5～10倍的水，在50～65℃下微波提取2～3次，每次提取时间为2～3小时，提取完后冷却至室温，并过滤得到提取液，合并多次提取液，得到橙花提取物a；
(2)将酵母菌接种到肉汤培养基中，在温度37℃、搅拌转速为50rpm的条件下培养48小时，取培养液于8000rpm下离心，离心后的湿菌体备用；
(3)酵母菌的聚乙烯醇—海藻酸钠固定化：采用聚乙烯醇水溶液与海藻酸钠水溶液配制含质量百分比6％～10％的聚乙烯醇和质量百分比1％～3％的海藻酸钠的混合溶液，然后向混合溶液中加入总溶液体积的1～3％的步骤(2)中制备的酵母菌湿菌体，配制成混合液，用蠕动泵经过1～5mm孔径的针头将配制好的混合液逐滴加入到cacl2的质量百分比为1～3％的硼酸饱和溶液中，交联1h形成小球，然后将小球取出再加入饱和na2so4溶液中交联3-5h，得pva-sa固定化酵母菌小球，然后采用无菌水冲洗，烘干备用；
(4)将步骤(1)中制备的橙花提取物a与步骤(3)中制备的固定化酵母菌小球按照质量比5～10:1混合，在温度为15～22℃，搅拌转速为1～5rpm的条件下发酵3～5d，然后置于4℃冷柜中保存7～14d；
(5)将步骤(4)发酵后发酵液过滤，得澄清发酵液，然后将过滤后的发酵液进行冷冻干燥，其冷冻干燥的料液厚度为1～2厘米，真空度为10pa，干燥时间为6～12h；
(6)取步骤(5)中冷冻干燥后的发酵液，加入其质量2～4倍的80～95％酒精溶液，沉淀24～48小时，过滤取上清液在压力为0.1mpa，温度为45℃的条件下浓缩至相对密度为1.25～1.30；然后在浓缩物中加入丙二醇，得橙花提取物b，所述丙二醇的加入量为总质量的20％；
(7)将步骤(6)中制备的橙花提取物b，在压力0.5～5pa，进料温度为55℃～60℃，进料速度为5～15ml/min，刮板转速为80～100rpm的条件下进行分子蒸馏，取轻组分为橙花提取物。
本发明中采用的酵母菌为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)hhl-1，于2009年11月17日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m209272。
本发明采用的微生物固定化技术具有发酵处理效率高、固液分离容易、抗毒性强等优点，能够弥补传统生物工艺的不足。
本发明以橙花花为原料，利用固定化酵母菌发酵橙花提取物，获得了一种品质优良的烟用橙花提取物，该提取物在卷烟中具有丰富烟香，增加甜香和花香香韵、增加卷烟香气透发性，口腔余味较舒适。与现有橙花浸膏和橙花提取物相比，该橙花提取物在卷烟中香气更加丰富，甜香韵和花香韵更加明显，卷烟香气透发性更好；与悬浮酵母菌发酵相比，该方法制备的橙花提取物中酯类香气物质含量增加了13.68％～17.29％，苯乙醇含量增加了23.47％～30.11％，卷烟效果评价中，香气更加丰富，果甜香和花香韵更加明显，口腔余味更加舒适。该方法替代了橙花提取物传统的提取技术，更新了生物发酵制备工艺，使得其能够在卷烟中适用性增加，对烟用橙花提取物的制备提供了一条新途径。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细的描述。
本发明以下实施例中的pva-sa(聚乙烯醇-海藻酸钠)固定化酵母菌小球是按照以下方法采用聚乙烯醇(pva)和海藻酸钠(sa)对酵母菌进行固定化得到的：
(1)将酵母菌接种到肉汤培养基中，在温度37℃、搅拌转速为50rpm的条件下培养48小时，取培养液于8000rpm下离心，离心后的湿菌体备用；上述方法中养琼脂培养为常用的普通肉汤培养基，其具体配方为(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，最终ph7.3±0.1；
(2)酵母菌的聚乙烯醇—海藻酸钠固定化：采用聚乙烯醇水溶液与海藻酸钠水溶液配制含质量百分比6％～10％的聚乙烯醇和质量百分比1％～3％的海藻酸钠的混合溶液，然后向混合溶液中加入总溶液体积的1～3％的步骤(2)中制备的酵母菌湿菌体，配制成混合液，用蠕动泵经过1～5mm孔径的针头将配制好的混合液逐滴加入到cacl2的质量百分比为1～3％的硼酸饱和溶液中，交联1h形成小球，然后将小球取出再加入到饱和na2so4溶液中交联3-5h，得pva-sa固定化酵母菌小球，然后采用无菌水冲洗，烘干备用；所述含有1-3％cacl2的硼酸饱和溶液的量和饱和na2so4溶液的量并无特殊要求，含有1-3％cacl2的硼酸饱和溶液只需要能够使混合液产生沉淀，满足乳酸菌的固定化要求即可，na2so4溶液的只需要将小球完全浸泡便可；所述硼酸饱和溶液、饱和na2so4溶液均为饱和水溶液。
本发明中采用的酵母菌为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)hhl-1，于2009年11月17日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m209272。
实施例1，一种固定化酵母菌制备烟用橙花提取物的方法，包括以下步骤：
(1)取橙花，加入其质量5倍的水，在55℃下微波提取2次，每次提取时间为2小时，提取完后冷却至室温，并过滤得到提取液，合并多次提取液，得到橙花提取物a，两次提取的条件完全相同；
(2)将步骤(1)中制备的橙花提取物a与上述方法制备的pva-sa固定化酵母菌小球按照质量比5:1混合，在温度为15℃，搅拌转速为5rpm的条件下发酵4d，然后置于4℃冷柜中保存8d；
(3)将步骤(2)发酵后发酵液过滤，得澄清发酵液，过滤后的发酵液进行冷冻干燥，料液厚度为1～2厘米，真空度为10pa，干燥时间为10h；
(4)取步骤(3)冷冻干燥后的发酵液，加入其质量3倍的80～95％酒精溶液，沉淀24小时，过滤取上清液在压力为0.1mpa，温度为45℃的条件下浓缩至相对密度为1.25，然后在浓缩物中加入总质量20％的丙二醇，得橙花提取物b；
(5)将步骤(4)的橙花提取物b，在压力2pa，进料温度为55℃，进料速度为15ml/min，刮板转速为80rpm的参数条件下进行分子蒸馏，取轻组分为橙花提取物。
实施例1中制备的橙花提取物在卷烟中具有丰富烟香，果甜香和花香韵更加明显，口腔余味更加舒适，增加卷烟香气透发性。
实施例2，一种固定化酵母菌制备烟用橙花提取物的方法，包括以下步骤：
(1)取橙花，加入其质量10倍的水，，在60℃下微波提取3次，每次提取时间为3小时，提取完后冷却至室温，并过滤得到提取液，合并多次提取液，得到橙花提取物a，三次提取的条件完全相同；
(2)将步骤(1)中制备的橙花提取物a与上述方法制备的pva-sa固定化酵母菌小球按照质量比10:1混合，在温度为20℃，搅拌转速为3rpm的条件下发酵5d，然后置于4℃冷柜中保存14d；
(3)将步骤(2)发酵后发酵液过滤，得澄清发酵液，发酵液进行冷冻干燥，料液厚度为1～2厘米，真空度为10pa，干燥时间为12h；
(4)取步骤(3)冷冻干燥后的发酵液，加入其质量2倍的80～95％酒精溶液，沉淀24小时，过滤取上清液在压力为0.1mpa，温度为45℃的条件下浓缩至相对密度为1.30，然后在浓缩物中加入总质量20％的丙二醇，得橙花提取物b；
(5)将步骤(4)的橙花提取物b，在4pa，进料温度为60℃，进料速度为10ml/min，刮板转速为100rpm，进行分子蒸馏，取轻组分为橙花提取物。
实施例2中制备的橙花提取物具有丰富烟香，果甜香和花香韵更加明显，口腔余味更加舒适，增加卷烟香气透发性。
实施例3，一种固定化酵母菌制备烟用橙花提取物的方法，包括以下步骤：
(1)取橙花，加入其质量8倍的水，在60℃下微波提取2次，每次提取时间为3小时，提取完后冷却至室温，并过滤得到提取液，合并多次提取液，得到橙花提取物a，两次提取的条件完全相同；
(2)将步骤(1)中制备的橙花提取物a与上述方法制备的pva-sa固定化酵母菌小球按照质量比7:1混合，在温度为18℃，搅拌转速为5rpm的条件下发酵6d，然后置于4℃冷柜中12d；
(3)将步骤(2)发酵后发酵液过滤，得澄清发酵液，并将过滤后的发酵液进行冷冻干燥，料液厚度为1～2厘米，真空度为10pa，干燥时间为6～12h；
(4)取步骤(3)中冷冻干燥后的发酵液，加入其质量4倍的80～95％酒精溶液，沉淀48小时，过滤取上清液在压力为0.1mpa，温度为45℃的条件下浓缩至相对密度为1.30，然后在浓缩物中加入总质量20％的丙二醇，得橙花提取物b；
(5)将步骤(4)的橙花提取物b，在3pa，进料温度为57℃，进料速度为5ml/min，刮板转速为80rpm，进行分子蒸馏，取轻组分为橙花提取物。
实施例3中制备的橙花提取物具有丰富烟香，果甜香和花香韵更加明显，口腔余味更加舒适，增加卷烟香气透发性。
对比实验，申请人将本发明制备的橙花提取物与现有传统提取方法制备的橙花提取物、采用悬浮酵母菌发酵制备的橙花提取物按照正常加香方式添加到烟丝中，制成卷烟，并进行评吸，其评吸效果如下：
三种不同工艺制备的橙花提取在卷烟中的感官评价效果比较
从上述对比实验可以看出来，本发明中制备的橙花提取物添加到卷烟中效果更好，而且根据具体实验分析发现，与悬浮酵母菌发酵相比，该方法制备的橙花提取物中酯类香气物质含量增加了13.68％～17.29％，苯乙醇含量增加了23.47％～30.11％，卷烟效果评价中，香气更加丰富，果甜香和花香韵更加明显，口腔余味更加舒适。