本发明属于多肽药物制备方法技术领域，具体是一种卡贝缩宫素的制备方法。
背景技术：
中文名：卡贝缩宫素
英文名：Carbetocin
结构式：
分子式：C45H69N11O12S
多肽性状：白色疏松粉末
卡贝缩宫素(Carbetocin Acetate)是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素八肽类似物，其临床和药理特性与天然产生的催产素类似。卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达到高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。
现有的卡贝缩宫素制备方法多为固液合成法，且合成周期长，生产成本高，产品活性低，不利于卡贝缩宫素的大规模生产。ES2115543的合成方法中用到了LiOH、NaHCO3和DMAP原料，由此会导致产生许多杂质，降低产品的纯度和使用效果。CN200910106889的合成方法中采用了Cys(Alloc)原料，并以氯化锂为环化试剂进行环化，酸解后得到卡贝缩宫素，该方法存在催化剂中毒的问题，Cys(Alloc)在去Alloc保护后-SH裸露，极易使四三苯基膦钯催化剂中毒而失效，从而严重影响去保护反应的效率。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种卡贝缩宫素的制备方法,以用于大规模生产卡贝缩宫素。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种卡贝缩宫素的制备方法，包括以下步骤：
将氨基树脂溶胀、脱保护并洗涤，并与活化的保护氨基酸溶液于30℃的恒温震荡器中反应40-90min，依次接入从树脂起算第1-8个氨基酸相对应的保护氨基酸以及N末端的4-氯基丁酸，得到卡贝缩宫素前体肽Ⅰ-氨基树脂：丁酸(Cl)-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-Rink-AM-Resin；
其中，保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH；
(2)将卡贝缩宫素前体肽Ⅰ-氨基树脂脱保护并洗涤后抽干至颗粒状，加入切割试剂，进行切割反应、沉降后，得到卡贝缩宫素前体肽Ⅱ：丁酸(Cl)-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2；
(3)将卡贝缩宫素前体肽Ⅱ溶于溶剂中，经反相高效液相色谱法纯化除杂，然后在固定的碱性条件下用乙腈水溶液进行液相环化，得到卡贝缩宫素粗肽Ⅲ；
(4)将卡贝缩宫素粗肽Ⅲ用反相高效液相色谱法纯化、冻干，得到卡贝缩宫素纯品多肽。
优选的，步骤(1)氨基树脂为Rink Amide-MBHA Resin，其取代度为0.35～0.5mmol/g；所述的溶胀是指将氨基树脂浸没在DCM溶剂中2h。
优选的，步骤(1)活化的保护氨基酸溶液制备方法为：将保护氨基酸和HOBt加入到离心管中，加入DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC，混合使其完全溶解得到活化的保护氨基酸溶液。
优选的，步骤(1)和(2)所述的脱保护并洗涤是指：将溶液抽干后，加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶与DMF混合溶液，置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空泵将溶液抽干；再加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇1min，用真空泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤树脂，重复操作3次。
优选的，步骤(2)所述的切割试剂100ml配置为：87.5ml TFA+5ml茴香硫醚+5ml H2O+2.5ml EDT+5g苯酚；切割反应条件为：置于20r/min的脱色摇床上切割反应90-100min；所述的沉降选用-20℃低温预冷的无水乙醚，离心沉降3次。
优选的，步骤(3)所述的溶剂为15％乙腈和水的混合溶液，所述的固定碱性条件为用DIEA调节反应溶液pH至9.0，环化反应条件为室温反应，环化反应时间为48h。
优选的，步骤(3)和步骤(4)所述的纯化选用十八烷基硅烷键合硅胶C18柱，5um制备柱进行反相高效液相色谱纯化，以B.Cone/％(2→50)，0→60min的梯度程序进行多肽的分离提纯。
本发明的另一个目的在于提供一种卡贝缩宫素纯品多肽的制备方法。
本发明的有益效果：本发明利用Fmoc固相合成原理，开发了固相合成技术，采用常见易得、低成本的试剂合成制备，通过工艺优化，卡贝缩宫素粗品收率高达90％以上，其纯品得率达到30-40％，大大提高了卡贝缩宫素的得率；发明操作简单，反应过程取样方便，易于中控，并且合成周期短，生产成本低，副产物少，产品收率高，利于工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。
本发明合成制备卡贝缩宫素，以氨基树脂为起始树脂载体，氨基树脂为Rink Amide-MBHA Resin，其取代度为0.35～0.5mmol/g；通过固相合成法依次缩合卡贝缩宫素氨基酸序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸以及N末端的4-氯基丁酸，经活化剂和缩合剂缩合反应及脱保护剂的脱保护反应，得到卡贝缩宫素前体肽Ⅰ-氨基树脂，之后洗涤树脂并进行切割、沉降后，得到卡贝缩宫素前体肽Ⅱ，前体肽Ⅱ经过纯化除杂和环化得到卡贝缩宫素粗肽Ⅲ，卡贝缩宫素粗肽Ⅲ经过纯化及冻干后得到卡贝缩宫素纯品多肽。
固相合成法依次缩合的Fmoc-保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH，以及N末端的4-氯基丁酸，缩合反应中氨基酸投料量为所投氨基树脂摩尔数的2-4倍，缩合反应温度为20-40℃。缩合反应所使用的活化剂和缩合剂分别为DIC、HOBt，缩合反应时间为20-50min；脱保护剂为20％哌啶/DMF的混合溶液，洗脱时间为15-30min。
卡贝缩宫素纯化工艺中选用十八烷基硅烷键合硅胶(C18)柱，5um制备柱进行反相高效液相色谱纯化，以B.Cone/％(2→50)，0→60min的梯度程序进样多肽的分离提纯，收集目标多肽溶液并冻干，得到卡贝缩宫素纯品多肽。
实施例1
氨基树脂的溶胀：称量取代度为0.38mmol/g的Rink-MBHA-Resin 0.1g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀2h。
1、卡贝缩宫素前体肽Ⅰ-氨基树脂的合成
卡贝缩宫素前体肽Ⅰ-氨基树脂为：
丁酸(Cl)-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-Rink-AM-Resin
本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1-8个氨基酸相对应的保护氨基酸以及N末端的4-氯基丁酸，分子量如下表1所示：
表1
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
保护氨基酸的活化方法
以Fmoc-Gly-氨基树脂的缩合为例，按照计算的理论投料量称取24mg Fmoc-Gly-OH和13mg HOBt于离心管中，加2ml DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加10ul DIC，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。
树脂的脱保护以及洗涤方法
将氨基树脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶与DMF混合溶液，置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空泵将脱保护溶液抽干；再加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇1min，用真空泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤树脂，重复操作3次。
茚三酮显色检测合格后，将上述的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于30℃的恒温震荡器中反应90min。采用上述同样方法，依次接入第2-8个氨基酸对应的Fmoc-保护氨基酸以及N末端的4-氯基丁酸，即得到卡贝缩宫素前体肽Ⅰ-氨基树脂。
2、卡贝缩宫素前体肽Ⅱ的合成
将反应器中的树脂用真空泵抽干至颗粒状，配置10ml切割试剂：8.75ml TFA+0.5ml茴香硫醚+0.5ml H2O+0.25ml EDT+0.5g苯酚，加入到反应器中，反应器置于20r/min的脱色摇床上反应90min。多肽的沉降选用-20℃低温预冷的无水乙醚，离心沉降3次，得到乳胶状的粗肽样品。
将粗品冻干后称重，得到粉末状样品36mg，根据粗品的量和合成测定实际取代度(SD＝0.31mmol/g)计算的理论量，计算粗品收率达到90％，比现有技术仅60％的收率有大幅度的提高。
3、卡贝缩宫素粗肽Ⅲ的制备
用15％乙腈和水的混合溶液溶解卡贝缩宫素前体肽Ⅱ，经反相高效液相色谱法纯化制备除杂，制备条件为：C18制备柱，流动相为A(0.1％乙酸/水)/B(0.1％乙酸/乙腈)，流速9ml/min，检测波长210nm，制备梯度程序
收集样品峰溶液，冻干后称重得样品为13mg，计算卡贝缩宫素粗肽Ⅲ收率达到37％。
4、卡贝缩宫素纯品多肽的制备
将卡贝缩宫素粗肽Ⅲ用乙腈：水＝2：1进行环化，用DIEA调节pH至9.0，室温反应；每隔3h测一次pH，调节pH；环化时间48h。
将环化后的多肽冷冻干燥，按上述纯化方法纯化；经冻干、称量得到卡贝缩宫素纯品多肽11mg，纯度达到98.3％，纯品收率为31％。按峰面积归一化法计算，卡贝缩宫素纯品多肽中的已知杂质单个杂质不超过0.5％，单个未知杂质不超过0.2％，未知杂质总和不超过1.0％；总杂质不超过2.0％。
实施例2
氨基树脂的溶胀：称量取代度为0.45mmol/g的Rink-MBHA-Resin 2g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，浸泡过夜。
1、卡贝缩宫素前体肽Ⅰ-氨基树脂的合成
卡贝缩宫素前体肽Ⅰ-氨基树脂为：
丁酸(Cl)-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-Rink-AM-Resin
保护氨基酸的活化方法
以Fmoc-Gly-氨基树脂的缩合为例，按照计算的理论投料量称取510mg Fmoc-Gly-OH和255mgHOBt于离心管中，加12ml DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加200ul DIC，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。
树脂的脱保护以及洗涤方法
将氨基树脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶与DMF混合溶液，置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空泵将脱保护溶液抽干；再加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇1min，用真空泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤树脂，重复操作3次。
茚三酮显色检测合格后，将上述的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于30℃的恒温震荡器中反应40min。采用上述同样方法，依次接入表1中第2-8个氨基酸对应的Fmoc-保护氨基酸以及N末端的4-氯基丁酸，即得到卡贝缩宫素前体肽Ⅰ-氨基树脂。
2、卡贝缩宫素前体肽Ⅱ的合成
将反应器中的树脂用真空泵抽干至颗粒状，配置100ml切割试剂：87.5ml TFA+5ml茴香硫醚+5ml H2O+2.5ml EDT+5g苯酚，加入到反应器中，反应器置于20r/min的脱色摇床上反应100min。多肽的沉降选用-20℃低温预冷的无水乙醚，离心沉降3次，得到乳胶状的粗肽样品。
将粗品冻干后称重，得到粉末状样品762mg，根据粗品的量和合成测定实际取代度(SD＝0.36mmol/g)计算的理论量，计算粗品收率达到91％。
3、卡贝缩宫素粗肽Ⅲ的制备
用15％乙腈和水的混合溶液溶解卡贝缩宫素前体肽Ⅱ，经反相高效液相色谱法纯化制备除杂，制备条件为：C18制备柱，流动相为A(0.1％乙酸/水)/B(0.1％乙酸/乙腈)，流速13ml/min，检测波长210nm，制备梯度程序
收集样品峰溶液，冻干后称重得样品为255mg，计算卡贝缩宫素纯品Ⅲ收率达到35％。
4、卡贝缩宫素纯品多肽的制备
将卡贝缩宫素粗肽Ⅲ用乙腈：水＝2：1进行环化，用DIEA调节pH至9.0，室温反应；每隔3h测一次pH，调节pH；环化时间48h。
将环化后的多肽冷冻干燥，按上述纯化方法纯化；经冻干、称量得到卡贝缩宫素纯品多肽194mg，纯度达到98.2％，纯品收率为30.5％。
本发明利用Fmoc固相合成原理，开发了固相合成技术，采用常见易得、低成本的试剂合成制备，通过工艺优化，卡贝缩宫素粗品收率高达90％以上，其纯品得率达到30％以上，大大提高了卡贝缩宫素的得率；本发明操作简单，反应过程取样方便，易于中控，并且合成周期短，生产成本低，副产物少，产品收率高，利于工业化生产。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对实施案例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施案例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。