本发明属于生物医学技术领域，具体的说是一种青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽QHA改造体抗菌肽HC14及其制备方法和应用。
背景技术：
近年来传统抗生素的大规模滥用导致越来越严重的病原微生物耐药问题，给人类健康带来巨大的威胁。临床上应对耐药微生物感染的措施是使用对耐药微生物尚未使用过的新的或者替代性的抗生素，因此这就需要持续开发新的抗微生物药物。
抗菌肽是生物体基因编码的一种天然小分子多肽，是生物体免疫系统的一种重要分子，对细菌、真菌、病毒甚至原虫均具有直接的杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简单、抗菌活性强、杀菌机制独特、毒性低和不易引起耐药性等优点，因此自发现之日起就被认为是具有极大开发潜力的新一代抗生素。到目前为止，已从不同生物体中发现超过1500多种不同的抗菌肽，而且其数目还在增加。
虽然抗菌肽数量增加，但活性好且稳定性高的抗菌肽数量并不多，以天然抗菌肽为模板进行改造，是发现新型理想抗菌肽最为快速高效的方法。抗菌肽的改造可以从氨基酸顺序、替换、增减、构型等改变方式入手，对于合成抗菌肽而言，序列短、活性强、稳定性高、毒性低是抗菌肽改造的最终目的。
抗菌肽药物研究多数应用于局部用药，尤其是皮肤感染药物研究。目前皮肤常见感染菌株已经出现了严重的耐药性，如对铜绿色假单孢菌有活性的抗菌素,包括氧哌嗪青霉素、头孢他定、头孢哌酮、头孢吡圬和碳青霉烯类等抗生素出现了显著耐药，如对金黄色葡萄球菌比较敏感的抗生素只有万古霉素和利福平效果较好。国外很多公司在开发抗菌肽新药以解决越来越严重的抗生素耐药性问题，抗菌肽药物由于其独特的杀菌机理和广谱的抗菌消炎活性，在未来市场具有非常大的发展空间。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽QHA改造体抗菌肽HC14及其制备方法和应用。
改造体抗菌肽为青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽QHA改造体HC14，其是直链多肽，含有16个氨基酸残基，其C末端酰胺化，分子量2022.58Da，等电点12.31。
所述改造体抗菌肽氨基酸序列为：Phe1Phe2Lys3Arg4Leu5Leu6Lys7Ser8Val9Arg10Arg11Ala12Val13Lys14Lys15Phe16-NH2。
改造体抗菌肽的应用，所述改造体抗菌肽用于制备抗菌药物、防感染药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体的用途。
本发明的有益效果在于：本发明根据青环海蛇抗菌肽QHA的氨基酸序列，利用分子改造方法设计改造体HC3-5，该改造体具有广谱高效的抗菌活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单、稳定性高等有益特点。
具体实施方式:
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
海蛇改造体抗菌肽HC14的化学合成
青环海蛇抗菌肽QHA是基因编码的一种直链多肽，含有30个氨基酸残基，分子量3628.5Da，等电点12.61。青环海蛇抗菌肽QHA全序列为：Lys1Phe2Phe3Lys4Arg5Leu6Leu7Lys8Ser9Val10Arg11Arg12Ala13Val14Lys15Lys16Phe17Arg18Lys19Lys20Pro21Arg22Leu23Ile24Gly25Leu26Ser27Thr28Leu29Leu30。根据青环海蛇抗菌肽QHA的氨基酸序列，利用分子改造方法设计获得了改造体HC14，并利用多肽固相合成的方法对其进行了化学合成，具体制备方法如下：
Ⅰ、HC14的制备方法：根据上述HC14的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，利用HPLC反相柱层析脱盐。
Ⅱ、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
Ⅲ、纯化的HC14用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
测定结果为：
HC14是青环海蛇抗菌肽QHA的一种改造体。HC14是一种直链多肽，含有16个氨基酸残基，其C末端酰胺化，分子量2022.58Da，等电点12.31。HC14全序列为：Phe1Phe2Lys3Arg4Leu5Leu6Lys7Ser8Val9Arg10Arg11Ala12Val13Lys14Lys15Phe16-NH2。
实施例2
HC14药理实验：
1.HC14抗菌活性测定：
(1)分别挑取保存于斜面上的试验菌株均匀涂布于MH固体培养基(购自青岛海博生物技术 有限公司)平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的抗菌肽HC14样品溶液10μl，于37℃倒置培养18－20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。
(2)抗菌肽HC14最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration)测定(2倍稀释法)：
选择上步实验中具有抑菌圈的菌株进行MIC测定实验。试验菌株接种到MH液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)中，37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的培养液稀释到2×105cfu/ml待用。
在无菌96孔板各孔中预先加入100μl MH液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用MH液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的的抗菌肽HC14样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释(参见表1)，自第9孔吸出100μl弃去，第10孔系对照管。
表1稀释方法
将上述各管混匀后放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。
由表2可见，抗菌肽HC14对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均表现出很强的抗菌活性，其中包括大量临床分离致病菌，MIC值处于2.34-150μg/ml的范围。而对于皮肤如烫烧伤感染常见菌株金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌等MIC处于4.69-37.5。
表2抗菌肽HC14抗菌活性
MIC：最小抑菌浓度，以上结果为三次独立重复实验平均值；实验菌株数字1/2等代表临床分离的不同致病微生物。
2.HC14溶血活性测定：
将采集的兔血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成107-108cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的HC14样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝A样品-A阴性对照/A阳性对照×100％。
结果表明样品浓度为100μg/ml，HC14的溶血百分比为3.67％，在浓度为200μg/ml时，HC14的溶血百分比为6.50％，说明HC14具有较低的溶血活性，不易引起哺乳动物红细胞破裂溶解。
实施例3
HC3-5稳定性实验：
人血清稳定性实验
用注射器抽取健康人血5ml，分装到灭菌的离心管中，室温放置2h，然后置于4℃冰箱过夜。2000rpm离心10min，淡黄色上清液即为人血清。用移液器吸出血清，分装到灭菌离心管中，-20℃冰箱保存。
将Hc3-5抗菌肽样品与人血清按一定比例混合，使Hc3-5抗菌肽样品的浓度为200μg/ml，血清浓度为25％，阴性对照为样品溶解液水与血清混合物。将混合物置于37℃培养箱孵育，于0到6h，按照实施例1中最小抑菌浓度测定方法，检测血清处理后Hc3-5抗菌肽对大肠杆菌1的抗菌活性。
表4抗菌肽HC3-5血清稳定性