本发明涉及免疫学检测技术领域，尤其是涉及一种酶标记抗原抗体的制备方法 。
背景技术：
免疫学检测技术具有检测速度快、费用低廉、仪器简单易携、灵敏度高和选择性强等优点，可用于现场检验。它将酶催化反应的放大作用和抗原抗体亲和反应的高度专一性、特异性相结合，以酶标记的抗原或抗体作为关键试剂进行免疫测试，所以具有很高的灵敏度。用于标记抗原或抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。当前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。辣根过氧化物酶（HRP）是从植物辣根中提取的一种酶，这种酶含有血红素, 能利用H2O2 氧化许多有机和无机化合物。该酶有着广泛的商业用途，例如可作为临床诊断和免疫测定的试剂等。HRP含有308个氨基酸残基，分子量约为40KD，含糖量约为18%（Nigel C.Veitch.Horseradish peroxidase:a modern view of a classic enzyme[J].ELSEVIER.65(2004) 249-259）。
用于蛋白质分子交联的方法制备酶标记抗原抗体主要包括混合酸酐法、重氮化合物法、戊二醛法、过碘酸钠法等等，每种方法都有其优缺点，具体交联方法的选择还需根据目标分子可用活性官能团（羧基、氨基、醛基、羟基、巯基等）进行确定。根据HRP分子特点，大多利用过碘酸钠法进行酶标抗原、抗体的制备。过碘酸钠法基本原理是：利用过碘酸钠的氧化性将HRP分子中邻羟基氧化为醛基，然后再与伯氨基反应生成西佛碱，通过还原剂将西佛碱还原为稳定的碳氮单键。大多数抗原抗体都为蛋白质大分子物质，表面具有赖氨酸残基暴露出的伯氨基，可用来与HRP分子上活化后的醛基进行反应。
传统过碘酸钠法在对某些抗原、抗体进行标记时存在着一些弊端，例如实验周期长、交联效率低、酶标抗原抗体反应性较差等，这就在一定程度上限制了其应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种酶标记抗原抗体的制备方法，采用本发明方法制备酶标记抗原、抗体，能够缩短酶标记抗原、抗体实验周期，同时提高酶分子与抗原、抗体的交联效率，提升酶结合物的反应性。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的酶标记抗原抗体的制备方法如下：首先利用过碘酸钠的氧化性将辣根过氧化物酶分子中邻羟基氧化为醛基，透析除去小分子物质后，在酶溶液中加入冻干保护剂进行冷冻干燥处理，待用；
在进行抗原、抗体标记时，首先对抗原、抗体碱化处理，将其伯氨基暴露后，再加入上述冷冻干燥处理的醛基化后的辣根过氧化物酶分子进行交联反应，反应时间1~1.5h，反应结束后加入防冻保护剂，-20℃低温条件下长期保存。
所述过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶时，过碘酸钠与辣根过氧化物酶之间的摩尔比为20:1，反应时间为30min ；终止反应后按照每毫克辣根过氧化物酶加入20ul终止液，终止反应时间15 min。
所述终止液为乙二醇。
透析除去小分子物质所用的透析液为酸性醋酸盐缓冲液；所述酶溶液中加入的冻干保护剂为10%海藻糖。
所述抗原、抗体为表面含有氨基的蛋白质分子，碱化处理是将待标记样本在pH 9.6 0.01~0.02 M 碳酸盐缓冲液透析过夜或加入pH 9.6 0.5M 碳酸盐启动剂，其中启动剂的加入量为待标记样本体积的1/5。
进行交联反应时，反应温度为室温；交联反应结束后加入还原剂，将不稳定的西佛碱还原为稳定的碳氮双键，其中所用还原剂为浓度4mg/ml的硼氢化钠，加入量按1mg辣根过氧化物酶加25ul硼氢化钠计。
交联反应结束后加入的防冻保护剂为与酶结合物等体积的丙三醇。
本发明通过将蛋白质交联技术与冷冻干燥技术相结合，并对传统过碘酸钠法进行了改良优化，大大缩短了酶标抗原、抗体的实验周期，同时提高了辣根过氧化物酶（HRP）与抗原、抗体的交联效率，提升了酶标结合物的反应性。具体来说，其优点体现在以下几点：
1、交联反应实验周期短。传统过碘酸钠法标记抗原、抗体实验周期为4-5d；本发明利用冷冻干燥技术将醛基化之后的HRP冷藏保存备用，在进行反应时，将抗原、抗体碱化处理后即可进行交联反应，整个实验周期仅为1-2d，大大缩短了实验周期。
2、HRP与抗原、抗体偶联后酶结合物的反应性强于传统过碘酸钠法。采用本发明工艺制备的酶结合物与传统过碘酸钠法相比，在多个项目评价酶结合物效价至少提升2倍。
3、酶结合物稳定性好。在-20℃条件下保存三年，酶结合物反应性无明显变化，与传统工艺制备的酶结合物稳定性基本一致。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明所述的酶标记抗原、抗体的制备方法做更加详细的说明。
一、酶标记抗体的制备方法如下：
第一步，HRP的醛化反应
用去离子水将HRP配制成5mg/ml的溶液，过碘酸钠配制成30mg/ml的溶液，按照HRP : 过碘酸钠 = 1:20（摩尔比）之比例将过碘酸钠加入到HRP溶液中，4℃条件下反应30min；按照20ul/1mg HRP量加入所需乙二醇作为醛化反应终止液，在4℃条件下反应30min；终止反应结束后，用pH 5.0 2.0mM醋酸盐缓冲液4℃透析12h，透析期间换液3次。
第二步，HRP冷冻干燥
准确测量透析后的HRP浓度（可根据初始反应称量HRP质量计算HRP浓度）。根据HRP体积，加入10%海藻糖（质量体积比）作为冻干保护剂，海藻糖彻底溶解后，按照2mg/瓶量分装至西林瓶中；采用快速预冻方式将HRP预冻4h，再迅速转入冷冻干燥机中进行冻干。冻干结束后压塞加盖，-20℃以下避光干燥保存。
第三步，交联反应
酶标抗体制备方法如下：
量取2mg 抗体在pH 9.6 0.02M 碳酸盐缓冲液透析过夜进行碱化处理；按抗体与HRP反应质量比为1:1之比例，在2mg冻干HRP中加入2mg碱化后的抗体，室温避光反应1h，再加入50ul 4mg/ml的硼氢化钠溶液，室温反应1h后加入酶结合物等体积的丙三醇，-20℃低温避光保存。
酶标记抗原制备方法如下：
量取3mg 抗原，按照抗原体积1/5计算量加入启动剂（pH 9.6 0.5M 碳酸盐）进行碱化处理；按抗原与HRP反应质量比为3:2之比例，在2mg冻干HRP中加入3mg碱化后的抗原，室温避光反应1h，再加入50ul 4mg/ml的硼氢化钠溶液还原剂，室温反应1h后加入酶结合物等体积的丙三醇，-20℃低温避光保存。