本发明属于微卫星分子标记领域，具体涉及一种达氏鲟微卫星标记及其筛选方法和应用。
背景技术：
微卫星标记(SSRs：simple sequence repeats)或短串联重复(Short tandem repeats，STRS)，是一种广泛应用的遗传学领域的DNA分子标记。SSRs是广泛存在真核生物基因组中的简单重复DNA片段，一般每个重复单位为1-6个碱基。SSR与其它遗传标记相比较，具有位点众多，多态性程度高，检测时对DNA模板要求程度低，检测简单快速的优点，是一个良好的遗传标记。微卫星DNA的高突变性、共显性表达及其在真核生物基因组中的普遍性，使其成为群体遗传多样性的分析、亲缘关系的鉴定、基因组作图和遗传育种的优越的分子标记，与等位酶、RAPD方法相比也有一定的优越性。SSR标记虽然效果好，可靠性高，但其关键点又在于SSR引物的开发。只有在有一定数量的SSR引物之后，才可能对某一物种进行SSR标记的分析。开发微卫星引物的方法有：1、经典的构建与筛选基因组、转录组文库的方法；2、微卫星富集法；3、近缘种的引物(例如同属不同种)；4、数据库搜寻法：在GenBank等公共数据库中搜寻SSR序列，根据侧翼序列设计引物。针对那些大多数测序很少的物种，第1种方法为最有效的方法。
达氏鲟又称长江鲟、沙腊子，是我国特有物种，主要分布于长江干流及金沙江下游，以四川宜宾-合江段产量较高。近20年来，由于葛洲坝工程的兴建以及水体污染、过度捕捞等原因，达氏鲟的野生资源量已经极其稀少，1988年被列为国家一级重点保护动物和长江上游一级急切保护鱼类。因此，迫切需要采取人工繁殖和增殖放流等技术及时有效地对该物种进行保护。本发明中利用高通量测序技术开发的8个微卫星标记位点，不仅对其遗传多样性的检测、遗传图谱构建和人工增殖放流效果评估等提供基础数据，还可后续用于达氏鲟的亲子鉴定等研究领域，来防止近亲衰退，指导人工繁殖。
技术实现要素：
本发明的目的是提供达氏鲟微卫星标记及其扩增引物，即提供8个达氏鲟的微卫星标记，以及相应的扩增引物，为达氏鲟的种群遗传多样性分析、亲子鉴定及分子标记辅助育种技术提供有效的工具。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：1、一种达氏鲟微卫星分子标记，所述分子标记具有SEQ ID No.1-8中任意一条或多条的核苷酸序列。
本发明还提供一种达氏鲟微卫星分子标记在达氏鲟遗传多样性分析、遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、亲子关系鉴定中的应用。
本发明还提供一种筛选达氏鲟微卫星分子标记，包括以下步骤：
(1)达氏鲟cDNA文库的构建：用TRIzol试剂盒提取达氏鲟组织RNA、构建达氏鲟转录组文库；
(2)测序数据质量控制：高通量测序得到的原始图像数据经Illumina Casava碱基识别软件分析转化为原始测序序列，随后对原始序列进行质量评估及统计；
(3)组装：原始测序序列(raw reads)经过滤处理得到高质量测序序列(clean reads)，采用Trinity软件对clean reads进行拼接得到转录本序列，取每条基因中最长的转录本作为unigene；
(4)SSR检测：对于已经组装好的数据，用QDD3软件进行SSR检测，并设计SSR引物，鉴定其在不同达氏鲟个体中的多态性，筛选出具有稳定性和多态性的引物。
本发明还提供一种适于分子标记的特异性引物，具有SEQ ID No.9-24中任意一条或多条的核苷酸序列。
本发明还提供一种利用分子标记的特异性引物分析其在不同达氏鲟个体中的多样性的方法，包括以下步骤：
(1)实验材料的准备：达氏鲟采样，并分别提取用于检测分析的每个个体的基因组DNA；
(2)PCR扩增：利用权利要求2所述的引物，以提取的不同个体的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，退火30秒，72℃延伸30秒，变性至延伸三个步骤重复32次，最后72℃充分延伸8分钟，4℃保存；
(3)电泳检测：对PCR扩增产物进行聚丙烯酰氨凝胶电泳进行检测，对于有多样性的引物进一步用荧光标记进行分型以确认条带大小；
(4)结果分析：用ATetra软件计算期望杂合度，Shannon-wiener多样性指数以及检测哈迪-温伯格平衡，以此来描述达氏鲟相关微卫星DNA多态性的特征
本发明的有益技术效果是：本发明利用高通量测序技术对达氏鲟进行微卫星分子标记的开发不仅比传统方法更为快捷，花费更少，而且在获得微卫星位点的同时可以查找对应EST序列的功能性状，与基因关联性较强。本发明开发出的微卫星位点，不仅为达氏鲟的遗传多样性提供了基础数据，也可进行遗传多样性分析、遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、亲子关系鉴定等研究领域。根据实际需要，可以采用本发明公开的任意一种或多种标记，或与相关标记对应的任意一对或多对特异性引物进行分析研究。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
达氏鲟微卫星位点和特异性引物的获得和验证：
达氏鲟样品收集及RNA提取：
从四川省水产研究所挑选四尾健康、性腺已分化的达氏鲟，解剖取其性腺进行total RNA的提取，具体步骤如下：(1)将达氏鲟性腺组织约30mg放入预冷的研钵中，利用液迅速研磨成粉末，放入1.5mL离心管中，并加入1mLTRIzol；(2)离心管中加入200μL的氯仿，剧烈震荡15s，室温静止3min；(3)4℃，12,000r/min离心10min，吸取上清放入新的离心管中；(4)加入与上清等体积的异丙醇，轻摇混匀，室温放置5-10min；(5)4℃，12,000r/min离心10min，弃去上清，小心吸去剩余异丙醇；(6)加入1mL 75％的乙醇，充分洗涤沉淀，4℃，7,500r/min离心1min，短暂离心，吸去剩余乙醇，重复一次该步骤；(7)室温晾干乙醇，加入20μL DEPC处理水使RNA充分溶解；(8)取1uL左右的样品进行电泳检测RNA质量，并用紫外分光光度仪检测RNA浓度和质量。
达氏鲟转录组的测序、拼接及组装并查找微卫星位点：
RNA样品检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I和RNase H合成二链cDNA，再用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA先进行末端修复、加A尾并连接测序接头，再用AMPure XP beads进行片段大小选择。最后进行PCR扩增，并用AMPure XP beads纯化PCR产物，得到最终的文库。文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1.5ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nM)，以保证文库质量，经CASAVA 1.8软件进行碱基识别(Base Calling)和Bcl2Fastq分析转化为原始测序序列。去除原始序列的接头和低质量序列，获得高质量序列，采用Trinity软件对其进行从头组装，得到147,265个达氏鲟的Unigenes。用QDD3软件在Unigenes序列中进行微卫星位点的查找，随机挑选出80对SSR序列用Primer3软件进行引物设计。
达氏鲟基因组DNA提取：
达氏鲟DNA的制备采用CTAB法进行，具体步骤如下：(1)将达氏鲟的鳍条约30mg放入1.5mL离心管中；(2)离心管中加入500μL的组织裂解液(Tris-HCl 10mM，EDTA 100mM，SDS 0.6％，NaCl 400mM，10M NaOH调节pH＝7.5)，用干净的剪刀将组织剪碎，离心管中加入1μl 20mg/ml蛋白酶K；(3)55℃水浴3h，每隔半个小时轻轻颠倒混匀；(4)向离心管中加入120μl饱和NaCl，混匀，冰上放置5～10min；(5)4℃，12000r/min离心10min，并转移上清液(约500μL)到另一干净1.5mL离心管中；(6)加入等体积的异丙醇，轻摇，放置5min；(7)4℃，12000r/min离心10min，弃上清液；(8)加入1ml 70％预冷的乙醇洗涤DNA沉淀一次，自然晾干后以适量双蒸水溶液溶解DNA样品；(9)取1uL左右的样品进行电泳检测DNA质量，-20℃备用。
微卫星位点PCR扩增和多态性验证：
以达氏鲟的DNA为模板，在已获得的微卫星位点中随机选取，根据其两端序列，利用Primer3软件设计微卫星位点的特异性引物，进行PCR扩增，体系为10μL，包括50ng基因组DNA，1×PCR缓冲液，Mg2+(1.5mM)，1U Taq酶，dNTPs 0.2mM，正反引物均为0.25μM。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s(各个微卫星位点的最佳退火温度不同)，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸8min，最后4℃保存。
PCR扩增完成后，利用8％的非变性聚丙烯凝胶电泳验证其多态性，具体步骤如下：(1)胶的制备：用自来水和洗涤剂把玻璃长板和耳板洗净晾干后夹紧，配制PAGE胶(纯水41mL，5×TBE Buffer14mL,40％丙烯酰胺14mL，10％APS650μL，TEMED65μL)并沿灌胶口灌进两个板中间，轻轻插上梳子，聚合至少2h。(2)电泳：将玻璃板放入电泳槽，上下槽分别加入0.5×TBE Buffer，将梳子拔出并加样，150V恒电压电泳120min。(3)银染：电泳完成后将胶取出，用纯水浸泡片刻；用0.1％AgNO3浸泡并轻摇20min左右；用纯水摇晃洗涤；称取10g NaOH和0.4g Na2CO3配制0.5L显色液，量取1.5mL甲醛加入其中，轻摇显色；待显色完毕，条带清晰，将胶放在纯水中终止显色；(4)置于凝胶成像系统中拍照，筛选出不同位点具有扩增稳定，杂带少的微卫星引物。
对微卫星引物多态性的检测：
分别用FAM、HEX、TAMRA三种荧光对非变性聚丙烯凝胶电泳初筛后有多态性的引物进行标记，选取43个达氏鲟个体DNA作为模板进行PCR扩增。
将扩增产物避光保存，在ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析以确定达氏鲟微卫星标记在不同个体上的等位基因大小。
遗传多样性分析：根据每个微卫星扩增产物的等位基因大小确定基因型，用ATetra软件计算期望杂合度，Shannon-wiener多样性指数以及检测哈迪-温伯格平衡，以此来描述达氏鲟相关微卫星DNA多态性的特征。
如表1所示，在43个达氏鲟样本中对上述8个微卫星标记进行遗传多样性分析的结果表明：微卫星标记的期望杂合度的范围从0.3831到0.8369，Shannon-Wiener多样性指数从0.6541到1.9663，从而证明本发明筛选的微卫星标记和设计的引物具有遗传多态性。
表1 8个微卫星标记的多态性相关信息
综上所述，本发明开发出了达氏鲟8个具有多态性的微卫星位点。本发明的微卫星标记及其扩增引物还可用于达氏鲟的遗传多样性、放流效果评估、亲缘关系分析及分子标记辅助育种等领域研究。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川省农业科学院水产研究所
<120> 一种达氏鲟微卫星标记及其筛选方法和应用
<130> 权利要求书、说明书
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 156
<212> DNA
<213> ADX11分子标记核苷酸序列
<400> 1
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<212> DNA
<213> ADX13分子标记核苷酸序列
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<212> DNA
<213> ADX23分子标记核苷酸序列
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<212> DNA
<213> ADX31分子标记核苷酸序列
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<213> ADX37分子标记核苷酸序列
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<212> DNA
<213> ADX44分子标记核苷酸序列
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<212> DNA
<213> ADX54分子标记核苷酸序列
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<212> DNA
<213> ADX64分子标记核苷酸序列
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