水稻抗褐飞虱基因Bph31(t)的分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及水稻抗褐飞虱基因Bph31(t)的分子标记及其应用。
背景技术：
：褐飞虱是水稻生产上的一种重要害虫，不仅直接危害水稻，还在取食过程中传播其他病害和病毒，严重威胁我国水稻的安全生产。发掘和鉴定新的抗虫基因，选育抗虫品种是最经济有效的防治手段。自20世纪60年代，国内外科学家开始筛选和鉴定抗褐飞虱材料，在栽培稻和野生稻材料中已陆续发现了一大批抗虫资源，截至目前，根据文献统计共有36个褐飞虱抗性基因得到鉴定，其中21个为显性基因，15个为隐性基因，其中，30个主效的抗虫基因已被命名。仅有2个抗虫基因Bph14和BPH29被成功克隆(邱永福等，2014；Duetal.,2009；JenaandKim,2010；Huangetal.,2013；Heetal.,2013；Wuetal.,2014；Wangetal.,2015)。一些已鉴定的抗虫基因已广泛应用于抗褐飞虱的分子标记辅助育种中，并取得了显著的进展。然而近年研究发现，仅具有某一个主效抗虫基因的水稻品种在生产上极易丧失抗性，而一些具有微效基因的品种通过其对主效基因的修饰，在持久抗性方面起着重要作用。例如，水稻品种IR64在连续种植多年以后仍能保持对褐飞虱的抗性，后经鉴定发现它除了携带一个主效的抗性基因Bph1之外，还包含几个与抗性相关的微效数量性状座位(Quantitativetraitloci，QTL)(Cohenetal.,1997)。迄今为止，利用不同的水稻材料，研究者们已检测到的褐飞虱抗性QTL分布于水稻所有的染色体(吴昌军等，2005；Sunetal.,2007；Liuetal.,2009)。在前期研究中，我们利用小粒野生稻与栽培稻IR24杂交、回交，结合胚拯救和分子标记辅助选择技术，构建了一套小粒野生稻导入系，通过抗褐飞虱鉴定，筛选获得了高抗褐飞虱且农艺性状稳定的水稻品系K41(郭嗣斌等，2012)。为了挖掘K41中的抗性基因及其紧密连锁的分子标记，本发明分别以感虫品种桂1025为母本，以抗虫品系K41为父本杂交，得到的F1再自交，从而构建了F2分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的F2:3家系，300个F2单株采用单粒传法，通过连续自交获得重组自交系群体(RILs，F7)。用亲本间有多态性的SSR标记分析F2单株的基因型，同时结合相应的F3家系的的平均抗虫级别进行QTL定位。结果表明在第4号染色体长臂RM3917和RM471间存在一个主效的QTL位点，LOD值为22.5，抗性贡献率为34.3％，暂名为Bph31(t)。为了寻找与Bph31(t)连锁更紧密的标记，用RM3917和RM471筛选了5000个F3单株。进一步利用这些多态性引物检测筛选获得了61个重组单株的基因型，结合其抗性鉴定结果，最后将Bph31(t)定位于MG81和RM471之间，并与标记MG96紧密连锁，参考日本晴基因组序列可知，MG81和MG96之间的物理距离约135kb。在将该抗性基因杂交转育到其它材料后，利用分子标记MG96检测抗性基因存在的准确率均达到97％以上，因此，利用两者之间的分子标记MG96来鉴定Bph31(t)的存在具有非常高的效率，这样也大大提高了抗褐飞虱水稻品种的育种进度。技术实现要素：鉴于上述内容，利用高抗褐飞虱的品种K41与髙感褐飞虱的品种桂1025杂交获得的F2:3家系群体及重组自交系群体，通过抗性鉴定和遗传分析，精细定位了水稻第4号染色体上的一个水稻抗褐飞虱基因Bph31(t)，获得与之紧密连锁的基于PCR扩增的实用经济型分子标记。该标记可以预测水稻材料是否对褐飞虱具有抗性，提高抗褐飞虱水稻品种的选择效率。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种水稻抗褐飞虱基因Bph31(t)的分子标记，其由下述之一的引物对经PCR扩增获得：(1)标记引物MG81正向引物序列：GGCAAACTCTTCTGATATGCTCTCC，反向引物序列：GCGCCAGAGATTGTGTGATCC；(2)标记引物MG96正向引物序列：ACAATTCATCCTATGCTTCTAGGC，反向引物序列：TCTATGCACGACGCCACGGAAGGTCCTAGCCA；(3)标记引物RM471正向引物序列：AGAAATGGATCGGACTGAACATGC，反向引物序列：AGACACTCGGACGCACAAGC；其中，所述标记引物(1)-(3)的扩增长度分别为140bp、184bp以及198bp。在本发明中，作为进一步说明，其所述标记引物(1)-(3)之一扩增待检水稻基因组DNA，如果用引物MG81能够扩增出140bp的扩增片段，或者用引物MG96能够扩增出184bp的扩增片段，或者用引物RM471能够扩增出198bp的扩增片段，则标志着该待检水稻存在水稻抗褐飞虱基因Bph31(t)，该基因位于水稻基因组第4号染色体18,200,000-19,000,000bp的区间内。在本发明中，作为进一步说明，所述基因Bph31(t)来自水稻抗虫品种K41或者水稻抗虫品种K41的衍生材料或者携带抗褐飞虱基因Bph31(t)的材料。要说明的是本发明中涉及的水稻抗褐飞虱基因Bph31(t)的受体材料包括稻属所有材料，如栽培稻和野生稻。如上所述水稻抗褐飞虱基因Bph31(t)的分子标记在选育抗褐飞虱水稻或筛选抗性基因资源中的应用。在本发明中，作为进一步说明，所述PCR扩增的反应体系：采用10μL的反应体系，模板DNA10ng，正向、反向引物各0.8μmol，10×PCR缓冲液1μL，dNTPs0.2mmol，TaqDNA聚合酶0.25U，用ddH2O补齐至10μL；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃50s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。与现有技术相比较，本发明具有以下有益效果：1.本发明的抗褐飞虱新基因与目前报道的位于水稻第4号染色体上的褐飞虱抗性基因都不同。目前已被定位于水稻第4号染色体上的褐飞虱抗性基因有10个。其中，Bph12、Bph15、Bph17、Bph20位于水稻第4号染色体短臂上，在标记RM8213与RM5953之间；bph12、bph16、BPH27(t)、Bph6位于水稻第4号染色体长臂上，在标记RM3643与RM5742之间；qBPH29(t)和BPH27分别位于标记RM401与RM3917之间和标记RM471与RM3643之间。而Bph31(t)位于标记RM3917与RM471之间，与以上10个抗性基因都不同，是源于小粒野生稻基因渗入系K41的一个抗褐飞虱的新基因位点。2.通过本发明得到的新基因标记的筛选，能够获得对褐飞虱抗性水平显著提高水稻新品种。3.本发明能利用Bph31(t)紧密连锁的分子标记来检测抗虫品种K41及其衍生品种(系)中是否含有该基因，筛出抗褐飞虱的新材料。本发明的分子标记可用于水稻抗褐飞虱分子标记辅助选择育种和聚合育种，在苗期育种群体的基因型选择，有效的鉴别抗褐飞虱的个体，便于及时杂交选育，加快育种进程。【附图说明】图1为水稻品系K41携带的抗褐飞虱基因Bph31(t)在第4号染色体长臂上与分子标记MG96的紧密连锁关系分布图；附图标记：A-Bph31(t)的初步定位；垂直线表示第4号染色体；水平短线表示染色体上的分子标记；括号内的数值表示标记间的遗传距离(cM)；B-Bph31(t)的精细定位；Bph31(t)定位于MG81和RM471之间135kb的区间，分子标记MG96与抗性基因紧密连锁。n表示筛选的F3重组单株总数；图2为分子标记MG96在不同水稻材料中扩增产物的电泳检测带型；附图标记：1为Marker；2为K41；3为桂1025；4-35为K41和桂1025杂交育种后代单株；图3为K41和桂1025杂交后代单株苗期褐飞虱抗性表现鉴定的结果图；附图标记：6为抗虫对照RH；7为感虫对照TN1；1-5和8-12为K41和桂1025杂交后代单株。【具体实施方式】本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如果没有作特别说明的，与常规使用的方法一致。实施例1：分子标记的获得(一)桂1025/K41F2家系群体和RILs的构建及表型鉴定1、在前期研究中，利用小粒野生稻与栽培稻IR24杂交、回交，结合胚拯救和分子标记辅助选择技术，构建了一套小粒野生稻导入系，通过抗褐飞虱鉴定，筛选获得了高抗褐飞虱且农艺性状稳定的水稻品系K41。为了挖掘K41中的抗性基因及其紧密连锁的分子标记，本发明分别以感虫品种桂1025为母本，以抗虫品系K41为父本杂交，得到的F1再自交，从而构建了F2分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的F2:3家系，300个F2单株采用单粒传法，通过连续自交获得重组自交系群体(RILs，F7)。2、采用苗期接虫处理，对亲本、F2:3家系和RILs进行抗虫鉴定。为确保亲本、F2:3家系和RILs中每个材料生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个材料各50粒种子播于一个长45cm，宽35cm，高8cm，且盛有5cm厚营养土的铁质托盘中。每个盘的每个材料播2个重复，其中随机播种亲本和TN1(感虫对照)各2个重复。播种7天后间苗，淘汰病弱苗。待苗长到两叶一芯期时，按8头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，最后罩上尼龙纱网。当感虫对照TN1全部死亡时，参照Qiu等(2012)的方法对每个单株进行0、1、3、5、7或9级的抗性评价(表1)，对每份材料通过加权平均计算该材料的抗性级别，上述抗虫鉴定重复两次，取平均值作为该材料的抗性级别，并推测其基因型。表1水稻苗期抗褐飞虱鉴定的分级标准抗性级别受害程度(当90％以上TN1死亡时考察)抗性水平0植株生长健康，无叶片受害抗(R)11片叶黄抗(R)31至2片叶黄，或1片叶枯萎中抗(MR)52至3片叶黄，或2片叶枯萎中抗(MR)73至4片叶叶枯萎，但植株未死亡感(S)9整株死亡感(S)(二)桂1025/K41F2群体的分子标记分析1、利用CTAB法(MurrayandThompsom,1980)提取亲本及F2群体各单株的叶片基因组DNA。2、根据Gramene网站(http://www.gramene.org/)公布的SSR标记按照较均匀的遗传距离选择一定数目的分子标记。另外，基于该基因最后的定位区段，参考水稻品种日本晴相应的基因组序列，利用SSR搜索工具SSRIT(http://www.gramene.org/db/marker/ssrtool)来寻找SSR基序，并根据其侧翼序列设计引物，为备选标记。其中，SSIT设置参数为：最小基序长度为3聚体，最小重复数为5，搜素所有的SSR基序。选择所有大于15碱基(基序长度×重复数)的SSR基序，最后基于该基因最后定位区段，比较该区段在水稻品系9311及日本晴相应的基因组序列，在两者具有差异的区段设计STS标记用于精细定位。表2多态性标记引物对、扩增产物大小及在第4号染色体上的位置3、DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳：参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，对每个单株分别提取基因组DNA。PCR扩增体系采用10μL的反应体系，模板DNA10ng，正向、反向引物各0.8μmol，10×PCR缓冲液1μL，dNTPs0.2mmol，TaqDNA聚合酶0.25U，用ddH2O补齐至10μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃50s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物在6％聚丙烯酰胺变性凝胶和银染显色法进行检测，或采取本领域已知的常规检测技术。4、根据F2单株的抗虫级别，分别选择15个极端抗虫单株和15个极端感虫单株的叶片基因组DNA混合构建抗、感池。利用在亲本间有多态性的引物分别筛选抗感DNA池，获得有多态性的分子标记，该类多态性标记很可能与抗性基因是连锁的。然后，选择连锁标记所在染色体上在亲本间有多态性引物筛选F2分离群体的各个单株，获得群体基因型数据。根据连锁交换规律，通过软件JoinMap3.0，利用群体基因型数据构建水稻部分遗传图谱，并获得各分子标记的遗传距离。最后，结合F2群体各个单株的基因型数据和相应的褐飞虱抗性鉴定的抗虫级别，利用软件NetWorkQTL3.0对目标染色体进行QTL位点扫描。(三)利用分子标记筛选桂1025/K41和Lemont/K41的F3重组单株精细定位Bph31(t)根据QTL的定位结果，利用初步定位两侧的SSR标记RM3917和RM471筛选F3单株，获得在两标记间发生重组的单株。同时在初步定位区段内筛选更多在亲本间具有多态性的引物，结合重组单株的基因型和表型，考察标记与抗虫表型共分离的情况。(四)结果与分析苗期集团法接虫鉴定结果表明K41和桂1025的平均抗虫级别分别为2.5和9.0，这表明K41高抗褐飞虱而桂1025高感褐飞虱。190个F2：3家系对褐飞虱的平均抗虫级别的频率分布呈连续分布，最小值为1.5，最大值为9.0。部分重组单株的基因型及表现型(见表3)。用亲本间有多态性的SSR标记分析F2单株的基因型，同时结合相应的F3家系的的平均抗虫级别进行QTL定位。结果表明在第4号染色体长臂RM3917和RM471间存在一个主效的QTL位点，LOD值为22.5，抗性贡献率为34.3％。分子标记RM3917和RM471在测序的粳稻品种日本晴基因组序列中的物理距离约0.7Mb，为了寻找与Bph31(t)连锁更精密的分子标记，本发明用RM3917和RM471筛选了5000个F3单株。同时在初步定位区段内筛选更多在亲本间具有多态性的引物。进一步利用这些多态性引物检测筛选获得了61个重组单株的基因型，结合其抗性鉴定结果，最后将Bph31(t)定位于MG81和RM471之间，并与标记MG96紧密连锁(图1，表3)，参考日本晴基因组序列可知，MG81和RM471之间的物理距离约135kb。在将该抗性基因杂交转育到其它材料后，利用分子标记MG96检测抗性基因存在的准确率均达到97％以上(图2)，因此，利用两者之间的分子标记MG96来鉴定Bph31(t)的存在具有非常高的效率，这样也大大提高了抗褐飞虱水稻品种的育种进度。表3部分重组单株的基因型及表现型备注：A,K41纯合基因型；B,桂1025纯合基因型；H,杂合基因型；R,抗；MR,中抗；S感；通过分析重组单株基因型和抗虫级别，最终将Bph31(t)基因定位于MG81和RM471之间。实施例2：分子标记的验证(一)材料与方法阴性品种：30份，感虫品系桂1025、Lemont、TN1均为本实验室保存的常规水稻材料，桂1025/K41杂交组合后代中感虫家系27份。阳性品种：30份，抗虫品系K41、桂1025/K41杂交组合后代中抗虫家系29份。分子标记引物：MG81、MG96和RM471。DNA提取方法和分子标记的分析方法同实施例1。(二)结果用上述方法，分别对水稻品系K41、桂1025、Lemont、TN1等60份不同样本的基因组DNA进行PCR扩增。结果表明，在阳性样本中均能扩增出相应的140bp片段、184bp片段以及198bp片段，而在阴性样本中均不能扩增出这些片段。由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有抗褐飞虱主效基因的样本，从而显著提高抗褐飞虱水稻材料的选择效率。前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在有权利要求书及其等同形式所限定。<序列表><110>广西农业科学院水稻研究所<120>水稻抗褐飞虱基因Bph31(t)的分子标记及其应用<160>6<170>Primer5.0<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>MG81（5ˊ端引物序列）<400>1GGCAAACTCTTCTGATATGCTCTCC25<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>MG81（3ˊ端引物序列）<400>2GCGCCAGAGATTGTGTGATCC21<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>MG96（5ˊ端引物序列）<400>3ACAATTCATCCTATGCTTCTAGGC24<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<223>MG96（3ˊ端引物序列）<400>4TCTATGCACGACGCCACGGAAGGTCCTAGCCA32<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>RM471（5ˊ端引物序列）<400>5AGAAATGGATCGGACTGAACATGC24<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>RM471（3ˊ端引物序列）<400>6AGACACTCGGACGCACAAGC20当前第1页1 2 3