一种茶叶籽酵母菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种茶叶籽酵母菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

茶叶籽油是以茶叶树(Camellia sinensis)的种子为原料生产的食用油，因其富含多种生物活性成分而被誉为东方橄榄油。目前有正式报道的茶叶籽油生产方法主要有冷压榨法、热压榨法、水酶法、一般溶剂浸出法及二氧化碳超临界萃取法，这些茶叶籽油生产工艺均存在一些难以克服的问题。为寻求解决问题的途经，姜金仲不久前报道了一种茶叶籽油生产新工艺——茶叶籽油生物发酵生产工艺，该工艺的核心是通过生物发酵将茶叶籽水浆分为三层，然后取出上层加热生产茶叶籽油。该工艺具有生产成本低、产量高、油品质高、茶叶籽油风味浓等优点。

既然生物发酵分层属于发酵范畴，其发生过程必然需要快速有效的发酵微生物。然而，茶叶籽水浆中含有大量的茶皂素，茶皂素对于大多数酵母菌具有抑制作用，所以，大多数酵母菌很难在茶叶籽水浆中繁殖生长，因此，能找到一种在茶叶籽水浆中快速繁殖生长的酵母菌成了该工艺的关键问题。经反复提纯、鉴定试验，我们找了一种能使茶叶籽水浆快速发酵的酵母——茶叶籽酵母(Meyerozyma caribbica JJZ11)。茶叶籽酵母与其他Meyerozyma caribbica菌株的最大不同点是它能利用茶叶籽水浆中的茶多糖作碳源引起茶叶籽水浆快速发酵，产生CO2及其他代谢产物，但不是所有Meyerozyma caribbica菌株均具有这种能力。

国外最早报道Meyerozyma caribbica是Kurtzman，并由他命名。Meyerozyma caribbica虽然有自己的属名及种名，但它却是发酵假丝酵母(Candida fermentati)的无性型，所以，又称为无性型发酵假丝酵母(anamorph Candida fermentati)。Kim报道过Meyerozyma caribbica的一个菌株：Meyerozyma caribbicaMG20W，认为该菌株具有嗜盐的特性，再加上茶叶籽酵母具有抗茶皂素的能力，说明Meyerozyma caribbica酵母具有适应不同生长环境的能力，因而具有广阔的开发利用潜力。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种茶叶籽酵母菌，其拉丁文名称为：Meyerozyma caribbica JJZ11，该茶叶籽酵母菌已经于2016年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2016470，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。

上述茶叶籽酵母的ITSrDNA序列如SEQ ID NO.1所示，26SrDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一目的是：提供上述茶叶籽酵母菌的制备方法，该方法是取新鲜茶叶籽仁适量放入容器，加入两倍量的25℃温水，恒温浸泡10～16h左右，用接菌环蘸取浸泡液并于MRS平板上划线培养，培养温度为25℃，长出菌落后，挑选独立的菌落，并用接种针挑取样本放在载玻片上，用美蓝染色，观察是否是酵母菌，如果是酵母菌，接种扩大繁殖该菌落，再行鉴定繁殖，反复4次，使最终平板上为同一形态菌落为止，则该菌落即为茶叶籽酵母菌。

本发明的另一目的是：提供上述茶叶籽酵母菌在植物油生产中的应用。

上述植物油的生产步骤为：称取茶叶籽仁加水于25℃条件下浸泡16～20h，将浸泡好的茶叶籽清洗后加水，其中茶叶籽:水＝1:3，然后进行2轮打浆、过滤得滤液，按照每升滤液加入1～5g茶叶籽酵母的比例向滤液中加入茶叶籽酵母菌，搅拌均匀，放入容器置于35℃恒温发酵8h后，滤液会出现白色顶层，捞出白色顶层加热，即可得到茶叶籽毛油。

本发明的另一目的是：提供上述茶叶籽酵母菌在生产红茶中的应用。

上述红茶的生产步骤为：取一芽二叶茶青，经揉搓机揉搓至有汁液渗出，按照每公斤鲜茶叶加入4～8g茶叶籽酵母的比例向汁液加入茶叶籽酵母，28℃恒温发酵，当闻到茶叶具有浓郁酵母香味时，将茶叶烘干即为具有茶叶籽酵母香味的红茶。

与现有技术相比，本发明的优点在于：现在所有的茶叶籽油生产工艺中，茶叶籽油均是直接从茶叶籽构成成分的混合物中提取，这些茶叶籽构成成分对茶叶籽油的提取率、茶叶籽油的构成成分及茶叶籽油的风味造成影响。而本发明利用茶叶籽酵母发酵技术，可以首先从茶叶籽构成成分的混合物中提取茶叶籽油脂体，将茶叶籽油脂体纯化后，再从油脂体中提取茶叶籽油出来；这样提取出来的茶叶籽油中茶叶籽其他构成成分残留量最低，保证了茶叶籽油的质量，而且大大简化了茶叶籽油后续加工工作。经实践证明，本发明达到了生产成本低、产量高、油品质好、茶叶籽油风味浓等理想生产指标。

附图说明：

图1为茶叶籽酵母菌落形态的显微照片；

图2为茶叶籽酵母个体特征及出芽情况的显微照片；

图3为茶叶籽酵母在酵母菌系统发育树中的位置。

具体实施方式

为了使本发明目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：菌株的筛选和保藏

本发明的茶叶籽酵母菌的制备方法为：称取鲜茶叶籽仁100g，加25℃温水200g，恒温浸泡10h后，用接菌环蘸取浸泡液并于MRS平板上划线培养，培养温度为25℃，长出菌落后，挑选独立的菌落，用接种针挑取样本放在载玻片上，用美蓝染色，观察是否是酵母菌，如果是酵母菌，接种扩大繁殖该菌落，再行鉴定繁殖，反复4次，使最终平板上为同一形态菌落为止，则该菌落为茶叶籽酵母菌。挑取单菌落接菌于MRS斜面培养基上，25℃培养48h，以备保藏和鉴定使用。

菌株的形态观察见附图1：茶叶籽酵母菌的菌落呈奶油状，乳白色，表面平伏，光滑反光。茶叶籽酵母菌28℃培养72h的个体形态如图2所示：细胞近球形、椭圆形或棒状，大小1.3-2.0μm×2.0-5.5μm，有假菌丝，出芽繁殖。

茶叶籽酵母菌的生理生化特征参见表1：参考《伯杰氏细菌鉴定手册》，以提纯的茶叶籽菌株为试材，分别对表中所列碳源化合物进行了测试，结果表明，除了肌醇及D-乳糖(牛源)外，其余碳源化合物均呈阳性，上述试验由“中国食品发酵工业研究院微生物检测中心”完成。

表1：茶叶籽酵母碳源利用

茶叶籽酵母菌ITSrDNA及26SrDNA的序列测定及分析

茶叶籽酵母菌ITSrDNA及26SrDNA的序列测定结果如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示：茶叶籽酵母菌的ITSrDNA序列全长为516bp,26SrDNA序列全长为533bp。参见附表2，利用Blest进行序列同源检索，相似度达到90％以上的酵母菌有7种，其中与Meyerozyma caribbica的相似度达到了100％。

表2：茶叶籽酵母菌ITSrDNA及26SrDNA序列与近缘酵母种同源性比较结果

以ITSrDNA及26SrDNA的同源性为基础，用MEGA5.0软件进行系统进化分析，结果得到了如附图3所示的系统发育树。系统发育学分析结果表明，该系统树中Meyerozyma caribbica CBS9966^T(FUNCBS/AY187283)是一个单独的外群种，茶叶籽酵母菌与该种单独构成一个分支；二者序列的相似性最大，遗传距离最小；因此，茶叶籽酵母菌与该种的亲缘关系最近；上述试验由“中国食品发酵工业研究院微生物检测中心”完成。

综合上述形态观察、生殖方式、假菌丝、碳源反应、ITSrDNA及26SrDNA的序列比对、以及系统发育树的构建与分析，“中国食品发酵工业研究院微生物检测中心”将茶叶籽酵母菌鉴定为：Meyerozymacaribbica，我们给予茶叶籽酵母菌的编号为JJZ11；因此，茶叶籽酵母菌定义为：Meyerozyma caribbica JJZ11。将茶叶籽酵母菌(或Meyerozyma caribbica JJZ11)于2016年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2016470。

实施例2：应用于植物油的生产

以油茶籽油为例：称取油茶(Camellia oleifera)籽仁1000g，加水于20℃条件下浸泡12h，将浸泡好的油茶籽清洗后加水，其中油茶籽：水＝1:3，然后进行2轮打浆、过滤得滤液，按照每升滤液加入5g茶叶籽酵母的比例向滤液中加入茶叶籽酵母菌，搅拌均匀，放入容器置于35℃恒温发酵10h后，滤液会出现白色顶层，捞出白色顶层加热，即可生产出油茶籽毛油。

实施例3：茶叶籽酵母菌用于生产红茶

取一芽二叶茶青，经揉搓机揉搓至有汁液渗出，按照每公斤鲜茶叶加入4g茶叶籽酵母的比例向汁液加入茶叶籽酵母干粉，搅拌均匀，28℃恒温发酵，当闻到茶叶具有浓郁酵母香味时，将茶叶烘干即为具有茶叶籽酵母特色的红茶；该红茶为经过微生物发酵分解的茶类，富含多种人体必需的氨基酸、天然抗氧化多肽、茶多酚、维生素、醋酸及乳酸，不但对人体有保健作用，还有特别酵母香味。

以上所述实施方式及应用领域仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所做出的任何显而易见的改动及应用领域的托广，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 贵州师范学院

<120> 一种茶叶籽酵母菌及其应用

<130> nm:

<160> 2

<170> PatentIn version

<210> SEQ ID NO：1

<211> 516

<212> DNA

<213> 茶叶籽酵母菌

<220>

<221> ITSrDNA

<400> 1

TACAGTATTC TTTTGCCAGC GCTTAACTGC GCGGCGAAAA ACCTTACACA 50

CAGTGTCTTT TTGATACAGA ACTCTTGCTT TGGTTTGGCC TAGAGATAGG 100

TTGGGCCAGA GGTTTAACAA AACACAATTT AATTATTTTT ATTGATAGTC 150

AAATTTTGAA TTAATCTTCA AAACTTTCAA CAACGGATCT CTTGGTTCTC 200

GCATCGATGA AGAACGCAGC GAAATGCGAT AAGTAATATG AATTGCAGAT 250

TTTCGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC ATTGCGCCCT CTGGTATTCC 300

AGAGGGCATG CCTGTTTGAG CGTCATTTCT CTCTCAAACC CCCGGGTTTG 350

GTATTGAGTG ATACTCTTAG TCGAACTAGG CGTTTGCTTG AAAAGTATTG 400

GCATGGGTAG TACTGGATAG TGCTGTCGAC CTCTCAATGT ATTAGGTTTA 450

TCCAACTCGT TGAATGGTGT GGCGGGATAT TTCTGGTATT GTTGGCCCGG 500

CCTTACAACA ACCAAA 516

<210> SEQ ID NO：2

<211> 533

<212> DNA

<213> 茶叶籽酵母菌

<220>

<221> 26SrDNA

<400> 2

GCTCAAATTT GAAATCTGGC ACCTTCGGTG TCCGAGTTGT AATTTGAAGA 50

TTGTAACCTT GGGGTTGGCT CTTGTCTATG TTTCTTGGAA CAGGACGTCA 100

CAGAGGGTGA GAATCCCGTG CGATGAGATG CCCAATCCTA TGTAAGGTGC 150

TTTCGAAGAG TCGAGTTGTT TGGGAATGCA GCTCTAAGTG GGTGGTAAAT 200

TCCATCTAAA GCTAAATATT GGCGAGAGAC CGATAGCGAA CAAGTACAGT 250

GATGGAAAGA TGAAAAGAAC TTTGAAAAGA GAGTGAAAAA GTACGTGAAA 300

TTGTTGAAAG GGAAGGGTTT GAGATCAGAC TCGATATTTT GTGAGCCTTG 350

CCTTCGTGGC GGGGTGACCC GCAGCTTATC GGGCCAGCAT CGGTTTGGGC 400

GGTAGGATAA TGGCGTAGGA ATGTGACTTT GCTTCGGTGA AGTGTTATAG 450

CCTGCGTTGA TGCTGCCTGC CTAGACCGAG GACTGCGATT TTATCAAGGA 500

TGCTGGCATA ATGATCCCAA ACCGCCCGTC TTG 533