生产5‑氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株的制作方法

本发明属生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株及构建及应用。

背景技术：

5-氨基乙酰丙酸，分子量为131.13，熔点为118℃。是一种非蛋白氨基酸。由于5-氨基乙酰丙酸具有副作用小、渗透性好的的特点，已经被广泛的应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌的诊断以及光动力治疗(PDT)中。

5-氨基乙酰丙酸是生物体内吡咯化合物的前体物，具有广泛的应用。在农业上，由于5-氨基乙酰丙酸在环境中容易降解，对哺乳动物无害，可以选择性杀死害虫，因此可以作为光动力学杀虫剂被广泛的应用。除此之外，5-氨基乙酰丙酸在提高农作物的抗冻害和耐盐能力以及调节植物生长等方面也受到了人们的广泛关注。在医学领域，5-氨基乙酰丙酸作为第二代光敏剂，不仅可以用于局部或全身的皮肤癌的治疗，还可用于膀胱癌、消化道癌以及肺癌等癌症的诊断。

据检索，现在尚未有将谷氨酸棒杆菌5-氨基乙酰丙酸运输蛋白基因过表达以提高5-ALA产量的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株。

本发明的第二个目的是提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株的应用。

本发明的技术方案概述如下：

生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032中敲除乳酸脱氢酶编码基因ldhA和乙酸生成基因pta-ackA、pqo和cat，得到的菌株命名为CG4；在CG4菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc前面插入sod启动子，得到菌株CG5；在CG5菌株中敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck，得到菌株CG6；

(2)在菌株CG6中转入构建好的过表达5-氨基乙酰丙酸合酶基因的质粒pXA，得到生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株L；

(3)在菌株L中转入构建好的过表达5-氨基乙酰丙酸运输蛋白质粒pEP-Ncgl0580，得到生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株L2。

上述方法构建的生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株L2。

上述生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株发酵生产5-氨基乙酰丙酸的用途。

本发明构建的生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株能促进5-氨基乙酰丙酸向谷氨酸棒杆菌胞外的运输，从而使得5-氨基乙酰丙酸的产量得到显著提高。与对照菌株比较，5-氨基乙酰丙酸的产量提高了100.4％。

附图说明

图1为质粒pXA的酶切验证图谱。

图2为基因Ncgl0580过表达的PCR验证图谱。

图3为工程菌株L、L1、L2在摇瓶中的发酵结果。

具体实施方式

机理：将Ncgl0580基因过表达质粒(pEP-Ncgl0580)导入生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌的工程菌株，能够促进5-氨基乙酰丙酸向谷氨酸棒杆菌胞外的运输，从而使得5-氨基乙酰丙酸的产量得到显著提高。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。

本发明所用到的：

原始菌株谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032购于ATCC(American Type Culture Collection，http://www.atcc.org/)；购买时间：2013.10，美国

原始质粒pK18mobsacB、pEC-XK99E、pXMJ19和pEP2购买于BioVector NTCC公司(http://www.biovector.net/)。

5-氨基乙酰丙酸标准品从sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)购买。所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从Thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)，所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。

实施例1：敲除质粒pD-sacB的构建和过表达5-氨基乙酰丙酸合酶基因质粒pXA的构建

pD-sacB质粒的构建

首先以HindIII切割后的pK18mobsacB线性片段作为模板，用如下引物sacB-1/sacB-2扩增sacB基因。将sacB基因片段经过MunI/EcoRV双酶切后与经过EcoRI/SmalI双酶切后的质粒pEC-XK99E进行连接，得到质粒pEC-XK99E-sacB。用如下的引物trcsacB-1/trcsacB-2，以pEC-XK99E-sacB质粒作为模板扩增含有trc启动子的trcsacB片段。

用如下的引物pD-1/pD-2，以pK18mobsacB质粒作为模板扩增含有卡那霉素抗性和大肠杆菌复制子的pD片段，最后将经过AatII酶切的片段trcsacB和经过相同酶切的pD片段进行连接，得到质粒pD-sacB。

pXA质粒的构建

将类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)的5-氨基乙酰丙酸合酶基因hemA根据谷氨酸棒杆菌的密码子偏好性进行密码子优化，将优化后的hemA基因用全基因合成的方法进行合成(如SEQ ID NO.39所示)，利用引物hemA-1/hemA-2扩增优化后的hemA片段(SEQ ID NO.39)，将得到的hemA片段经过PstI/XbaI双酶切后与经过相同双酶切后的穿梭质粒pXMJ19连接，得到pXA质粒，质粒pXA的酶切验证图谱见图1。

实施例2：乳酸脱氢酶编码基因ldhA的敲除和乙酸生成途径基因pta-ackA、pqo和cat的敲除

乳酸脱氢酶编码基因ldhA的敲除：

以谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032基因组为模板，以ldh-1/ldh-2为引物扩增基因ldhA的上游片段，ldh-3/ldh-4为引物扩增基因ldhA的下游片段。将两个片段切胶回收后，以等摩尔比例的片段为模板，以ldh-1/ldh-4为引物，扩增得到两个片段的融合产物。将融合后的片段用EcoRI/HindIII双酶切与经过同样双酶切后的pD-sacB连接，得到质粒pD-ldhA。

将pD-ldhA质粒转入到C.glutamicum ATCC 13032中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养，将菌液稀释1000倍涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。选择在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到5mL BHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物ldh-1/ldh-4进行PCR验证，得到ldhA基因敲除菌株CG1。

pta-ackA操纵子的敲除

以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板，以ackA-1/ackA-2为引物扩增操纵子pta-ackA的上游片段，ackA-3/ackA-4为引物扩增操纵子pta-ackA的下游片段。将两个片段切胶回收后，以等摩尔比例的片段为模板，以ackA-1/ackA-4为引物，扩增得到两个片段的融合产物。将融合后的片段用SalI/XbaI双酶切与经过同样双酶切后的pD-sacB质粒连接，得到pta-ackA操纵子敲除质粒pD-pta。

将pD-pta质粒转入到菌株CG1中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养，将菌液稀释1000倍涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。选择在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到5mLBHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物ackA-1/ackA-4进行PCR验证，在CG1的基础上得到pta-ackA操纵子敲除菌株CG2。

pqo基因的敲除

以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板，以pqo-1/pqo-2为引物扩增pqo基因的上游片段，pqo-3/pqo-4为引物扩增pqo的下游片段。将两个片段切胶回收后，以等摩尔比例的片段为模板，以pqo-1/pqo-4为引物，扩增得到两个片段的融合产物。将融合后的片段用XbaI/PstI双酶切与经过同样双酶切后的pD-sacB连接，得到pqo基因的敲除质粒pD-pqo。

将pD-pqo质粒转入到菌株CG2中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养，将菌液稀释1000倍涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。选择在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到5mLBHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物pqo-1/pqo-4进行PCR验证，在CG2的基础上得到pqo基因的敲除菌株CG3。

cat基因的敲除

以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板，以cat-1/cat-2为引物扩增cat基因的上游片段，cat-3/cat-4为引物扩增cat的下游片段。将两个片段切胶回收后，以等摩尔比例的片段为模板，以cat-1/cat-4为引物，扩增得到两个片段的融合产物。将融合后的片段用XbaI/SalI双酶切与经过同样双酶切后的pD-sacB连接，得到cat基因的敲除质粒pD-cat。

将pD-cat质粒转入到菌株CG3中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养，将菌液稀释1000倍涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。选择在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到5mL BHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物cat-1/cat-4进行PCR验证，在CG3的基础上得到cat基因的敲除菌株CG4。

其中BHIS培养基成分为(g/L)：牛脑心浸粉37，山梨醇91，余量为水。

BHIS固体培养基成分为(g/L)：牛脑心浸粉37，山梨醇91，琼脂2％(W/V)，余量为水

BHIS-Sucrose固体培养基(g/L)：牛脑心浸粉37，山梨醇91，琼脂2％(W/V)，蔗糖10％(W/V)，余量为水。

实施例3：在ppc基因前面插入强的sod启动子和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck的敲除

ppc基因前面插入sod启动子

以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板，以ppc-1/ppc-2为引物扩增基因ppc的上游片段。sod-1/sod-2用于扩增sod基因的启动子。ppc-3/ppc-4用于扩增ppc基因的下游片段，分别将3个片段切胶回收后，以等摩尔比例的片段为模板，用ppc-1/ppc-4为引物，扩增得到三个片段的融合产物。将融合后的片段用XbaI/HindIII双酶切后与经过同样双酶切后的质粒载体pD-sacB连接。得到质粒pD-ppc。

将构建好的质粒pD-ppc利用电转转入到菌株CG4中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养，将菌液稀释1000倍涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。将在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到5mLBHIS液体培养基中，提取基因组，送测序，在CG4的基础上得到在ppc基因前面插入sod启动子的菌株CG5。

pck基因的敲除

以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，用如下引物进行PCR扩增。pck-1/pck-2用于扩增基因pck的上游片段。pck-3/pck-4用于扩增基因pck的下游片段。将上游片段经过EcoRI/XbaI双酶切后与经过相同双酶切后的pD-sacB质粒连接，得到质粒pD-pck(F)，将构建的质粒pD-pck(F)经过PstI/HindIII双酶切后与经过PstI/HindIII双酶切的下游片段进行连接，得到pD-pck质粒。

将该质粒转入到菌株CG5中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养，将菌液稀释1000倍涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。将在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到5mL BHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物pck-1/pck-4进行PCR验证，在CG5的基础上得到pck基因的敲除菌株CG6。

将pXA质粒转入到CG6中，用氯霉素进行筛选，得到带有pXA质粒的5-氨基乙酰丙酸生产菌株L。

实施例4：过表达质粒pEP-tuf的构建和过表达运输蛋白质粒的构建

pEP-tuf的构建

以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，用如下引物进行PCR扩增。tuf-1/tuf-2用于扩增tuf启动子编码的基因。将扩增片段经过EcoRI/SalI双酶切后与经过相同酶切后的pEP2质粒连接。得到过表达质粒pEP-tuf。

将该质粒转入到菌株L中，用卡那霉素和氯霉素筛选重组成功的阳性克隆，30℃，将能够在双抗平板上生长的菌落接种到5mL BHIS液体培养基中，使用引物tuf-1/tuf-2进行菌液PCR验证，得到菌株L1。

pEP-Ncgl0580的构建

以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，用下列引物进行PCR扩增。Ncgl0580-1/Ncgl0580-2用于扩增基因Ncgl0580。将扩增片段经过XbaI/SaclI双酶切后与经过相同酶切后的pEP-tuf质粒连接。得到Ncgl0580基因过表达质粒pEP-Ncgl0580。

将pEP-Ncgl0580质粒转入到菌株L中，用卡那霉素和氯霉素筛选重组成功的阳性克隆，30℃，将能够在双抗平板上生长的菌落接种到5mL BHIS液体培养基中，使用引物Ncgl0580-1/Ncgl0580-2进行菌液PCR验证，得到菌株L2，见图2。

表1菌株构建所用引物序列(人工合成)

实施例6：利用构建的菌株进行5-氨基乙酰丙酸的摇瓶发酵

将菌株L、L1(对照)、L2在M2培养基中进行发酵。

菌株L接种方式为：首先在BHIS固体平板上活化菌株，在30℃培养至菌落可视时，挑单菌落接种至装有终浓度为10μg/mL氯霉素的BHIS液体培养基的试管中培养15小时左右，转接到含有相应抗生素的M1培养基中，在培养至OD₆₀₀＝10左右时，将种子接种到M2培养基进行发酵，培养基中添加终浓度为10μg/mL的氯霉素和0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在30℃，pH为7.0，220rpm，发酵30h。

菌株L1、L2接种方式为：首先分别在BHIS固体平板上活化菌株，在30℃培养至菌落可视时，挑单菌落接种至装有终浓度为8μg/mL氯霉素和终浓度为20μg/mL卡那霉素的BHIS液体培养基的试管中培养15小时左右，分别转接到含有相应抗生素M1培养基中，在培养至OD₆₀₀＝10左右时，将种子接种到M2培养基进行发酵，并在培养基中添加终浓度为8μg/mL氯霉素和终浓度为20μg/mL卡那霉素和0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在30℃，pH为7.0，220rpm，发酵30h。

发酵结果见图3。

M1培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，酵母抽提物10，胰蛋白胨10，NaCl 2.5，余量为水。

M2培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，酵母提取物7.5，硫酸氨10，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钾1，七水硫酸镁0.1，氯化钙0.02，3-(N-吗啉)丙磺酸21，甘氨酸7.5，余量为水。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大学

<120> 生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株

<130>

<160> 39

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cgtgccaatt ggataaagca ggcaagacct a 31

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cgtgcgatat cccatcggca ttttcttttg cgt 33

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

agctctgacg tcttatcatc gactgcacgg tgca 34

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

agctctgacg tccccatcgg cattttcttt tgcgt 35

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

agctctgacg tcaaccccag agtcccgctc agaagaa 37

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

agctctgacg tcatgatcct ccagcgcggg gatctcat 38

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

aatacgctgc agaaggagat atagatatgg actacaacct cgccctcg 48

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aatctctaga ttatgcgacg acctcggcg 29

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atcggaattc ccaaggtgcc gacactaat 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cggtgatttc gcaactccaa catctcctg 29

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ttggagttgc gaaatcaccg accacgaga 29

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ccggaagctt gcttccagac ggtttcatc 29

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

aggctctaga ccacgaacct tccagatcag 30

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ggaggcatcg gtggaaatca gaatccatcg aagctgcggt 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

accgcagctt cgatggattc tgatttccac cgatgcctcc 40

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

atgcgtcgac tgagtgaatc ccgcatccga 30

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

agagtctaga gttttcgagg cgaccagaca g 31

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

catccgatca aggaaggaac gcaccgcaga acaaagtgac ag 42

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ctgtcacttt gttctgcggt gcgttccttc cttgatcgga tg 42

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

agagaagctt gttaagcgct cgcggtcaat g 31

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

aggctctaga aaggaatcgc agaaccgcca 30

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

agccgttctt agccaggttg ccggagaaac caaccttgtc 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

gacaaggttg gtttctccgg caacctggct aagaacggct 40

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

atgcgtcgac gctgcggctg attttgctga 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

agataagctt aaatccgtga agctggcacc 30

<210> 26

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

cccggaataa ttggcagcta taactacttt aaacactctt tcac 44

<210> 27

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

gtgaaagagt gtttaaagta gttatagctg ccaattattc cggg 44

<210> 28

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

gtcatcgcgt aaaaaatcag tcatgggtaa aaaatccttt cgta 44

<210> 29

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

tacgaaagga ttttttaccc atgactgatt ttttacgcga tgac 44

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

agattctaga atgcgacggc ggatgttctt 30

<210> 31

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

atgagaattc tgtttgttaa taaatgggtt c 31

<210> 32

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

agcgtctaga tacttctcca gattttgtgt c 31

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 33

gtcgacctgc aggcagttca cgcttaagaa ctg 33

<210> 34

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 34

gacgaagctt cgaacaaacc cgacctgac 29

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 35

aatcgaattc tggccgttac cctgcgaatg 30

<210> 36

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 36

atcagtcgac gagctccgat aggatccagg tatctagatg tatgtcctcc tggactt 57

<210> 37

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 37

agcctctaga aaggagatat agatatgaat aaacagtccg ctgc 44

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 38

tagcgagctc ttaactaggt gtgtgtactc 30

<210> 39

<211> 1224

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 39

atggactaca acctcgccct cgataccgcc ctcaaccgtc tgcacactga aggccgctac 60

cgcaccttca tcgacatcga acgccgcaaa ggcgccttcc ctaaagccat gtggcgcaaa 120

cctgatggct ccgagaaaga gatcaccgtc tggtgcggca acgactacct gggtatgggt 180

cagcacccag tcgtgctcgg tgcaatgcac gaagccctgg attctactgg tgccggttcc 240

ggcggtaccc gcaacatctc tggtaccacc ctgtatcaca agcgcctgga agcagagctc 300

gccgatctcc acggtaagga agccgccctg gtgttctctt ccgcctatat cgccaacgac 360

gccactctgt ccactctgcc tcaactcatc ccaggcctcg tgatcgtctc cgacaagctc 420

aatcacgcct ccatgatcga gggcattcgc cgttctggca ccgagaagca catcttcaaa 480

cataatgacc tggacgacct ccgccgtatc ctgacttcta tcggcaagga tcgcccaatc 540

ctcgtggcct tcgagtccgt ctactccatg gacggcgact ttggtcgcat cgaggagatc 600

tgcgatatcg ccgacgagtt cggcgccctc aagtacatcg atgaggtgca cgccgtgggt 660

atgtacggtc ctcgcggtgg tggtgtcgcc gaacgtgatg gcctgatgga ccgcatcgac 720

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