本发明涉及一种利用生物柴油副产物甘油合成D-乳酸的重组菌及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
随着社会的发展，化石能源日益匮乏，由可再生原料合成生物燃料成为世界性研究热点。生物柴油是一种重要生物燃料，生产呈逐年增加趋势。生物柴油的生产，会产生大量的副产物甘油。据估算，每生产10吨生物柴油大约生成1吨粗甘油。甘油的大规模剩余，致使其价格处于持续偏低水平，已经成为一种资源丰富、价格低廉、亟待开发的碳源物质。
D-乳酸是一种重要的平台化合物，被广泛应用于医药、农药和化妆品等行业。高光学纯度D-乳酸可以作为聚乳酸的优良单体。将D-乳酸聚合单体以一定比例加入聚L-乳酸后，聚乳酸的机械性能、热力学性能等都会得到改善，熔点能够提高50℃左右。全球D-乳酸的需求量约2.6万吨，每年都以6％～8％的速度增长。全球聚乳酸市场每年约以20％～30％的速率增长；随着聚乳酸市场的逐渐推广，D-乳酸的需求量将进一步增加。
D-乳酸的合成方法主要有化学合成法、微生物酶法和微生物发酵法，综合考虑光学纯度、生产成本、产物浓度以及环境污染等因素，微生物发酵法存在一定优势。D-乳酸的发酵菌株以乳酸菌为主。乳酸菌是传统的乳酸发酵菌种，对乳酸的耐受性高、生产强度大、自身能够合成高浓度的乳酸。但是，大多数乳酸菌同时合成L-乳酸和D-乳酸，光学纯度比较差；想要得到高光学纯度的D-乳酸，需要将生产L-乳酸的关键酶L-乳酸脱氢酶敲除。还有一些乳酸菌，如Lactobacillus sakei、Lactobacillus curvatus和Lactobacillus plantarum等乳杆菌还存在乳酸消旋酶，该酶的存在使得菌株即使只有单一的乳酸脱氢酶，最终发酵产物只能是D,L-乳酸。另一方面，现有技术主要是以玉米等淀粉质原料发酵合成D-乳酸，受国家政策的影响，原材料价格较高。
技术实现要素：
本发明首先提供了一种利用生物柴油副产物甘油合成D-乳酸的重组菌。
所述重组菌是以肺炎克雷伯氏菌为出发菌株，将编码D-乳酸脱氢酶的基因ldhA导入肺炎克雷伯氏菌，或者导入敲除了编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因dhaT和/或编码醛还原酶/醇脱氢酶的基因yqhD的肺炎克雷伯氏菌，得到重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述D-乳酸脱氢酶基因ldhA，来源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)基因登录号为GI：6938538。
本发明还提供一种构建所述重组菌的方法，包括以下步骤：
1)PCR扩增肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇脱氢酶基因dhaT的上下游同源臂片段，拼接后得到基因敲除片段ΔdhaT。所获得的基因敲除片段ΔdhaT和自杀质粒pRE112进行酶切、连接；
2)将步骤1)所得的重组载体转化到E.colix7213；
3)将步骤2)所获得的重组菌与肺炎克雷伯氏菌共同培养，通过重组载体与肺炎克雷伯氏菌进行同源重组，获得敲除dhaT基因的基因缺失型菌株K.penumoniaeΔdhaT；
4)在K.penumoniaeΔdhaT基础上，参照步骤1)～3)所述步骤继续敲除醛还原酶/醇脱氢酶基因yqhD得到K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD；
5)克隆D-乳酸脱氢酶基因ldhA，将所得基因与质粒pBAD18进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆；
6)培养步骤5)所得的阳性克隆，并提取质粒，将所得的重组质粒pBAD18-LdhA，转化到宿主K.penumoniaeΔdhaT或者K.peneumoniaeΔyqhD或者K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD中，获得肺炎克雷伯氏菌重组菌。
本发明还提供一种应用所述重组菌发酵生产D-乳酸的方法，步骤如下：
1)活化重组菌，获得种子液；
2)将步骤1)所得的种子液，与含有卡那霉素的培养基，按照体积比种子液：发酵培养基＝1～2:100～130的比例接种后，35℃～37℃，180～220rpm条件下培养至OD600在0.6～0.8，获得培养液；
3)所得的培养液加入诱导剂阿拉伯糖至终浓度为0.01％～0.1％，然后转入30～33℃，180～220rpm条件下继续培养24～48小时。
在本发明的一种实施方式中，步骤2)所述培养条件为：37℃、180rpm。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基的碳源为低成本的生物柴油副产物甘油，氮源为无机氮源，例如氯化铵、硫酸铵等，其他成分为简单的无机盐成分。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基的配方为：0.42g/L一水合柠檬酸，1.6g/LNH4Cl，1g/L酵母粉，0.2g/LMgSO4·7H2O，100mmol/LpH＝7.0磷酸钾缓冲液，40g/L生物柴油副产物甘油。
在本发明的一种实施方式中，所述生物柴油副产物甘油的组成是：75.1％甘油，22.8％水，1.7％脂肪酸，0.12％甲醇，0.28％脂肪酸甲酯。
在本发明的一种实施方式中，将重组菌活化后，按1％的接种量接种到含100μg·mL-1的卡那霉素的发酵培养基中，37℃、180rpm条件下振荡培养，待OD600达到0.6时，温度调节至33℃，并加入0.01％阿拉伯糖进行诱导；此后，每隔12h添加一次0.01％～0.1％的阿拉伯糖和50mg/mL的卡那霉素，阿拉伯糖诱导后48h终止发酵。
本发明所获得的的有益效果如下：
针对以上问题，本发明以Klebsiella pneumoniae为宿主菌株，通过构建工程菌，以廉价的生物柴油副产物甘油为碳源，实现了100％光学纯度D-乳酸的合成，在产量和成本上具有一定优势。本发明所构建的重组菌具有利用生物柴油副产物甘油为唯一碳源合成D-乳酸的特点，发酵48h，可以得到12.7g/L的D-乳酸，转化率为50.4％，光学纯度为100％。以生物柴油炼制的副产物甘油为碳底物，降低了生产成本；通过进一步改良培养基和发酵条件，使产物转化率得到了提高。
定义和缩写
在本文中使用下列的缩写或简称：
D-乳酸脱氢酶基因：ldhA
1,3-丙二醇脱氢酶基因：dhaT
醛还原酶/醇脱氢酶基因：yqhD
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)：K.penumoniae
“基因缺失”或“基因敲除”指将目标基因从基因组中删除或使目标基因中的一部分删除，从而使目标基因失去表达其对应功能的蛋白质，导致功能缺失。
“电击转化”或“电转化”指分子生物学中转染技术的一种，用来将外来基因整合到宿主基因中并稳定表达，其利用高压电脉冲的电击穿孔作用将外来基因导入宿主基因或将外来质粒导入宿主原生质体，又称电击法或电融合法等。
“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即，野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
具体实施方式
下面通过实例来进一步阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方：
1)种子液摇瓶培养基
LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。
2)摇瓶发酵培养基
M9改良培养基：0.42g/L一水合柠檬酸，1.6g/L NH4Cl，1g/L酵母粉，0.2g/L MgSO4·7H2O，100mmol/L pH＝7.0磷酸钾缓冲液，40g/L生物柴油副产物甘油。
生物柴油副产物甘油含量：75.1％甘油，22.8％水分，1.7％脂肪酸，0.12％甲醇，0.28％脂肪酸甲酯。
在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100mg/L的卡那霉素。
实施例1基因的敲除
本实施例中，以肺炎克雷伯氏菌(K.penumoniae)野生菌株的1,3-丙二醇脱氢酶基因(dhaT)(Gene ID：7946507)上下游约500个碱基片段为模板设计引物，分别PCR扩增1,3-丙二醇脱氢酶基因(dhaT)上下游片段，再利用回收试剂盒回收目的基因片段。
上游扩增引物序列为：Kp-dhaT-Up-5'：5'-CGGGGTACCATGAGCTATCGTAT GTTTG-3'和Kp-dhaT-Up-3'：5'-GATGAGGCGGATCGCCTGCGATCACAAACTT CACTTTG-3'；下游扩增引物序列为Kp-dhaT-Down-5'：5'-CAAAGTGAAGTTTGTGATCGCAGGCGATCCGCCTCATC-3'和Kp-dhaT-Down-3'：5'-GTCCGAGCTCTCAGAATGCCTGGCGGAAAATCG-3'。
将上述扩增片段回收后，以回收片段为模板进行搭桥PCR获得用于敲除1,3-丙二醇脱氢酶基因(dhaT)的片段ΔdhaT，再利用回收试剂盒回收目的片段ΔdhaT，以自杀质粒pRE112为媒介(Robert A.Edwards,Linda H.Keller,Dieter M.Schifferli.Improved allelic exchange vectors and their use to analyze 987P fimbria gene expression.Gene 1998；207:149-157.)与K.penumoniae野生菌株进行同源重组敲除dhaT基因，通过PCR验证获得已经敲除dhaT的K.penumoniae工程菌即K.penumoniaeΔdhaT。
验证引物序列：ID-Kp-dhaT-del-5'：5'-GCATTATAACCTGAAGCGAG-3'和ID-Kp-dhaT-del-inside-3'：5'-CGAGGTTGGCGTTATTGAAAG-3'和ID-Kp-dhaT-del-3'：5'-TACGCCTGGCGGTGAAAGCGAC-3'。
醛还原酶/醇脱氢酶基因(yqhD)(Gene ID：6934748)的敲除方法参考1,3-丙二醇脱氢酶基因(dhaT)的敲除。
上游扩增引物序列为：Kp-yqhD-Up-5'：5'-ATGAGCTCTACAGCAGGCGGACGTCAGGC-3'和Kp-yqhD-Up-3'：5'-GGCTCGATGCCGCCAAATTC-3'；下游扩增引物为Kp-yqhD-Down-5'：5'-GAATTTGGCGGCATCGAGCCGTATCGATGCC GCTATTGCC-3'和Kp-yqhD-Down-3'：5'-ATTCTAGATGGTACGCGGCGGCGGTG TC-3'。验证引物序列：ID-K.p-yqhD-3’：5'-GGTGATGAACAGCTCATCGC-3'和ID-K.p-yqhD-5’：5'-GTCATCTGGCAGCGGTATCGT-3'。
在K.penumoniae野生菌株基础上，单独敲除yqhD时得到K.penumoniaeΔyqhD；在K.penumoniaeΔdhaT基础上，再敲除dhaT获得菌株为K.penumoniaeΔdhaTΔyqhD。
实施例2外源基因的克隆
本实施例中，获取来源于K.pneumoniae的D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)(Gene ID:6938538)，是以K.pneumoniae为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-CGAGCTCTATAATCACTGGAGAAAAGT-3'和5'-GCTCTAGAGAATCAGACGATGGCGTTCG-3')，再利用回收试剂盒回收目的片段。
实施例3表达载体的构建
将实施例2中获得的D-乳酸脱氢酶ldhA基因片段和质粒pBAD18用SacI和XbaI酶切，回收酶切产物，再进行连接，载体与ldhA基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1卡那霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pBAD18-ldhA后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定，用于过表达D-乳酸脱氢酶。
实施例4宿主肺炎克雷伯氏菌感受态细胞的制备
将实施例1中获得的基因缺失菌株K.peneumoniaeΔdhaT或者K.peneumoniaeΔyqhD或者K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD接种于20mL的LB液体培养基中，加入50μg·mL-1的氨苄青霉素，培养至一定菌体浓度。用灭菌离心管在4℃下5500rpm离心5分钟，去除上清，再用4℃保存的无菌水悬浮后再次离心，重复2次。再用无菌水重悬浮，分装，-80℃保存，得到感受态细胞。
实施例5K.peneumoniae合成D-乳酸光学性质的检测
将野生的肺炎克雷伯氏菌K.peneumoniae在LB培养基中活化，将活化后的重组菌株按1:100的比例接种到含有100mL的M9改良液体培养基的250mL摇瓶中(内含100μg·mL-1的卡那霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD600达到0.6左右时，温度调节至33℃，并加入0.01％阿拉伯糖进行诱导。此后，每隔12h添加一次0.01％～0.1％的阿拉伯糖和50mg/mL的卡那霉素，阿拉伯糖诱导48h后终止发酵。
取1mL发酵液，4℃，15000rpm离心10min，取上清，用液相色谱检测乳酸光学纯度，使用手性色谱柱和紫外检测器。用高效液相色谱检测产物浓度，使用紫外和示差检测器。
经检测，D-乳酸的光学纯度为100％。野生菌株合成D-乳酸的产量为0.12g，甘油到乳酸的转化率为0.31％，1,3-PDO的产量为9.6g/L(表1)。
实施例6将质粒pBAD18-ldhA导入K.peneumoniaeΔdhaT合成D-乳酸
将实施例3中获得的表达载体pBAD18-ldhA通过电击转化导入实施例4中获得的K.peneumoniaeΔdhaT感受态细胞中，涂布到含有卡那霉素的LB固体平板；涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆。
将获得的工程菌株单克隆在LB培养中进行活化，活化后的菌株按1:100的比例接种到含有100mL的M9改良液体培养基的250mL摇瓶中(内含100μg·mL-1的卡那霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD600达到0.6左右时，温度调节至33℃，并加入0.01％阿拉伯糖进行诱导。此后，每隔12h添加一次0.01％～0.1％的阿拉伯糖和50mg/mL的卡那霉素，阿拉伯糖诱导后48h终止发酵。
取1mL发酵液，4℃，15000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测产物浓度(表1)，使用紫外和示差检测器。
经检测，D-乳酸产量为9.3g/L，甘油到乳酸的转化率为32.0％，相对于实施例5，产量和转化率分别提高了76.5倍和102.2倍；1,3-PDO的产量为2.7g/L，相对于实施例5，降低了71.9％(表1)。
实施例7将质粒pBAD18-ldhA导入K.peneumoniaeΔyqhD合成D-乳酸
将实施例3中获得的表达载体pBAD18-ldhA通过电击转化导入实施例4中获得的K.peneumoniaeΔyqhD感受态细胞中，涂布到含有卡那霉素的LB固体平板；涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆。
将获得的工程菌株单克隆在LB培养中进行活化，活化后的菌株按1:100的比例接种到含有100mL的M9改良液体培养基的250mL摇瓶中(内含100μg·mL-1的卡那霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD600达到0.6左右时，温度调节至33℃，并加入0.01％阿拉伯糖进行诱导。此后，每隔12h添加一次0.01％～0.1％的阿拉伯糖和50mg/mL的卡那霉素，阿拉伯糖诱导后48h终止发酵。
取1mL发酵液，4℃，15000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测产物浓度(表1)，使用紫外和示差检测器。
经检测，D-乳酸产量为9.6g/L，甘油到乳酸的转化率为33.8％，相对于实施例5，产量和转化率分别提高了79倍和108倍；1,3-PDO的产量为2.4g/L，相对于实施例5，降低了75％(表1)。
实施例8将质粒pBAD18-ldhA导入K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD合成D-乳酸
将实施例3中获得的表达载体pBAD18-ldhA通过电击转化导入实施例4中获得的K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD感受态细胞中，涂布到含有卡那霉素的LB固体平板；涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆。
将获得的工程菌株单克隆在LB培养中进行活化，活化后的菌株按1:100的比例接种到含有100mL的M9改良液体培养基的250mL摇瓶中(内含100μg·mL-1的卡那霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD600达到0.6左右时，温度调节至33℃，并加入0.01％阿拉伯糖进行诱导。此后，每隔12h添加一次阿拉伯糖和抗生素，阿拉伯糖诱导后48h终止发酵。
取1mL发酵液，4℃，15000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测产物浓度，使用紫外和示差检测器。
经检测，D-乳酸产量为12.7g/L，甘油到乳酸的转化率为50.4％，相对于实施例5，产量和转化率分别提高了104.8倍和161.6倍；相对于实施例6，产量和转化率分别提高了36.6％和57.5％；相对于实施例7，产量和转化率分别提高了32.3％和49.1％。1,3-PDO的产量为2.1g/L，相对于实施例5，降低了78.1％；相对于实施例6，降低了22.2％；相对于实施例7，降低了12.5％(表1)。
表1不同菌株摇瓶发酵合成D-乳酸情况
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。