一种利用生物柴油副产物甘油合成D‑乳酸的重组菌及其应用的制作方法

文档序号:12248565阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种利用生物柴油副产物甘油合成D-乳酸的重组菌,其特征在于,所述重组菌是以肺炎克雷伯氏菌为出发菌株,将编码D-乳酸脱氢酶的基因ldhA导入肺炎克雷伯氏菌,或者导入敲除了编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因dhaT和/或编码醛还原酶/醇脱氢酶的基因yqhD的肺炎克雷伯氏菌,得到重组菌。

2.根据权利要求1所述的重组菌,其特征在于,所述D-乳酸脱氢酶基因ldhA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种构建权利要求1或2所述重组菌的方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)PCR扩增肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇脱氢酶基因dhaT的上下游同源臂片段,拼接后获得基因敲除片段ΔdhaT,所获得的基因敲除片段ΔdhaT和自杀质粒pRE112进行酶切、连接;

2)将步骤1)所得的重组载体转化到E.colix7213;

3)将步骤2)所获得的重组菌与肺炎克雷伯氏菌共同培养,通过重组载体与肺炎克雷伯氏菌同源重组,获得敲除dhaT基因的基因缺失型菌株K.penumoniaeΔdhaT;

4)在K.penumoniaeΔdhaT基础上,参照步骤1)~3)所述步骤继续敲除醛还原酶/醇脱氢酶基因yqhD得到K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD;

5)克隆D-乳酸脱氢酶基因ldhA,将所得基因与质粒pBAD18进行酶切、连接,并转入E.coliDH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆;

6)培养步骤5)所得的阳性克隆,并提取质粒,将所得的重组质粒pBAD18-LdhA,转化到宿主K.penumoniaeΔdhaT或者K.peneumoniaeΔyqhD或者K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD中,获得肺炎克雷伯氏菌重组菌。

4.一种应用权利要求1或2所述的重组菌发酵生产D-乳酸的方法,其特征在于,步骤如下:

1)活化重组菌,获得种子液;

2)将步骤1)所得的种子液,与含有卡那霉素的以生物柴油副产物甘油为碳源的发酵培养基,按照体积比种子液:发酵培养基=1~2:100~130的比例接种后,35℃~37℃,180~220rpm条件下培养至OD600在0.6~0.8,获得培养液;

3)向所得的培养液中加入诱导剂阿拉伯糖至终浓度为0.01%~0.1%,然后转入30~33℃,180~220rpm条件下继续培养24~48小时。

5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤2)所述培养条件为:37℃,180rpm。

6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,发酵培养基的碳源为生物柴油副产物甘油,氮源为无机氮源,其他成分为无机盐。

7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,氮源为氯化铵和/或硫酸铵。

8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述生物柴油副产物甘油的组成是:75.1%甘油,22.8%水,1.7%脂肪酸,0.12%甲醇,0.28%脂肪酸甲酯。

9.根据权利要求4~8任一所述的方法,其特征在于,发酵培养基的配方为:0.42g/L一水合柠檬酸,1.6g/LNH4Cl,1g/L酵母粉,0.2g/L MgSO4·7H2O,100mmol/L pH7.0的磷酸钾缓冲液,40g/L生物柴油副产物甘油。

10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,将重组菌活化后,按1%的接种量接种到含100μg·mL-1的卡那霉素的发酵培养基中,37℃、180rpm条件下振荡培养,待OD600达到0.6时,温度调节至33℃,并加入0.01%阿拉伯糖进行诱导;此后,每隔12h添加一次0.01%~0.1%的阿拉伯糖和50mg/mL的卡那霉素,阿拉伯糖诱导后48h终止发酵。

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